Учет численности микроорганизмов (КОЕ) в почве методом питательных пластин в сочетании с методом последовательных разведений

Методы учета численности микроорганизмов

Учет численности и выделение чистой культуры микроорганизмов

Почва — наиболее благоприятная среда для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка бepyт среднюю почвенную пробу (см. 10.1.1),

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содержащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой 6epyт из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фламбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.

Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят в колбу на 250 мл с 49 мл стерильной воды. Смесь в взбалтывают 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10-2 г почвы, и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10-3 г, во второй колбе – 10-4 г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1мл соответственно 10-5 и 10-6 г почвы.

Для определения численности микроорганизмов в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний более сложен и занимает больше времени. Поэтому для подсчета численности бактерий в почве методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов на плотных средах (см. главу 10).

Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут по 1 мл этих суспензий и переносят в стерильные чашки Петри, используя всякий раз новую стерильную пипетку (лучше пипетку Мора). На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Затем в чашки Петри вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (2/3 объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура агара должна быть примерно 45 °С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно пылить в чашку Петри. Осторожными круговыми движениями чашки, не смачивая крышку, aгар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 °С.

Клетки микроорганизмов, попав в питательную среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Через 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предварительно подсчитывают число колоний. В связи с тем, что существуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.

Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. Казалось бы, во всех вариантах посева должно получиться примерно одинаковое число КОЕ, однако на практике происходит не так.

Иногда клеток так много, что развившиеся колонии микроорганизмов сливаются, что часто наблюдается в чашках при разведении 10-2. При высоких разведениях вырастают единичные колонии (меньше 10 на чашке), которые могут образоваться от случайно попавших клеток из воздуха при внесении в чашку почвенной суспензии или питательной среды. Учет таких чашек сделает подсчет недостоверным. Для правильного определения численности КОЕ подсчитывают только чашки, в которых колоний свыше 10 и не более 250—300 (в последнем случае при условии, если колонии очень мелкие).

При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой. Можно использовать и специальный прибор для подсчета колоний.

Бывают случаи, когда в последнем разведении (10-6) число колоний значительно больше 300. Такой посев желательно повторить, увеличив число разведений. Если это невозможно, подсчет выполняют, учитывая, что он дает представление лишь о минимальной численности микроорганизмов в почве.

Метод питательных пластин легко выполним, но имеет ряд недостатков, самый существенный из которых — отсутствие универсальной среды для развития всех микроорганизмов, обитающих в почве. Питание у разных бактерий специфично, и на каждой среде выявляется довольно узкая физиологическая группа. Так, на МПА развиваются в основном гнилостные бактерии, способные усваивать легко доступные органические формы азота. Нитрифицирующие, целлюлозоразрушающие, азотфиксирующие и другие бактерии на этой среде не развиваются. Для более полного представления о населенности почвы делают посевы на элективные среды (см. 4.2.1) или используют метод прямого подсчета микроорганизмов под микроскопом.

Второй недостаток метода питательных пластин — вероятность неполного учета клеток в образце в связи с тем, что в одном месте в агаре может застыть не одна, а несколько клеток. Образованные ими колонии сливаются, создавая впечатление одной колонии. Если такие колонии имеют неоднородную структуру, можно внести поправку при подсчете, приготовив из них окрашенный препарат. Если под микроскопом обнаруживаются разные формы клеток, например кокки, палочки и сарцины, то считают, что это не одна колония, а, как в данном примере, три. Если все формы клеток одинаковые, то расценивают колонию как результат развития одной клетки (хотя в этом месте одинаковых клеток могло быть 5, 10 и более).

Для сравнения количества КОЕ в разных почвах необходимо подсчитать их число в 1 г абсолютно сухой почвы. С этой целью одновременно со взятием навески почвы для приготовления разведений в отдельный бюкс (металлический или стеклянный), высушенный до постоянной массы, берут навеску (5—10 г) для определения влажности почвы. Сушат почву при 105 °С до постоянной массы. Для определения числа КОЕ в 1 г сырой почвы определяют разность между массами сырой и сухой почвы, делят ее на массу навески и умножают на 100. Затем число клеток в 1 г сырой почвы надо разделить на количество абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

 

Пример расчета. В 1 г сырой почвы содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Определяем численность клеток в 1 г абсолютно сухой почвы:

 

0,7 г абсолютно сухой почвы содержат 5600 клеток

1,0 - х


 

Таким образом, в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 8 тыс. живых клеток.