Информационная емкость ДНК.

На Земле живет 6 миллиардов человек. Наследственная информация о них
заключена в 6x10⁹ сперматозоидах. По разным оценкам у человека от 30 до 50
тысяч генов. У всех людей ~ 30x10¹³ генов или 30x10¹⁶ пар нуклеотидов, которые

составляют 10¹⁷ кодонов. Средняя книжная страница содержит 25x10² знаков. ДНК 6x10⁹ сперматозоидов содержит информацию, равную по объему примерно

4x10¹³ книжных страниц. Эти страницы заняли бы объем 6-и зданий НГУ. 6x10⁹ сперматозоидов занимают половину наперстка. Их ДНК занимает менее четверти наперстка.

Лекция 6. Транскрипция.

Определение: транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.

У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.

Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей активированных нуклеотидов.

Принципы транскрипции:

1.Комплемептарность.

2.Антипараллельность.

3.Униполярность.

4.Беззатравочностъ.

5.Асимметричность.

РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'→3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке. Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.

Этапы транскрипции

1.Узнавание и прочное связывание

Как только произошло узнавание (позиция 1), РНК-полимераза перемещается в позицию 2. В каталитическом центре инициации транскрипции, находящемся в В-субьединице, оказывается +1-ый нуклеотид оперона. Переход из позиции 1 в позицию 2 возможен, если на операторе нет белка-репрессора.

Примерно 5% промоторов у прокариот имеют только участок "-10", однако, тем не менее, хорошо узнаются РНК-полимеразой. Такие промоторы представлены палиндромными последовательностями, принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.

Определение: палиндромы - последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево.

Палиндромы первого порядка имеют одну ось симметрии, второго - две, третьего - три.

2. Инициация заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации С- фактор покидает фермент.

3. Элонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции). Скорость элонгации 40-50 нукл./сек.

Для комплементарного синтеза РНК необходим разрыв водородных связей в ДНК. Core-фермент РНК- полимеразы покрывает примерно 40 пар нуклеотидов (4 витка спирали ДНК). Разрыв водородных связей на 4-х витках спирали - очень энергоемкий процесс. Он не был обнаружен при изучении транскрипции.

Показано, что РНК-полимераза переводит ДНК из В-формы в А-форму. В ней плоскости азотистых оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены на 20 к перпендикуляру. Это облегчает "выворачивание" двух соседних азотистых оснований в цепи ДНК для того, чтобы напротив них встали комплементарные нуклеотиды РНК. В пользу этого говорит полная идентичность параметров А-формы ДНК и гибрида, состоящего из одной цепи ДНК и одной - РНК. "Мотором" транскрипции является энергия, высвобождающаяся при отщеплении пирофосфата от каждого рибо-НТФ.

Ингибиторы транскрипции прокариот.

Существует множество ингибиторов транскрипции. Они действуют по разным механизмам и на разных стадиях. Большинство из них антибиотики.

Рифампицин - ингибитор инициации. Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы Е. coli.

Стрептолидигин - ингибитор элонгации. Связывается с центром элонгации core-PHK-полимеразы Е. coli.

4. Терминация.

Специфическая терминация бывает р-независимой и р- зависимой.

При р- независимой терминации в терминаторе присутствует палиндром. В синтезируемой РНК формируется шпилька. Шпилька меняет конформацию РНК-полимеразы и фермент теряет сродство к ДНК.

р -зависимая терминация.

р-фактор - это имеющий четвертичную структуру белок? Обладающий АТФ-азной актив-ностью.

Он способен узнавать 5 -конец синтезируемой РНК длиной прибли-зительно 50 нуклеотидов, садиться на него и двигаться по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК.

В терминаторе много Г — Ц пар (с тремя водородными связями), вследствие чего РНК-полимераза замедляет ход, р-фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента - и синтез РНК прекращается.

Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli.

РНК-полимераза E.coli - белок с четвертичной структурой. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеразы.

Субъединичный состав фермента: (2α)ββ’σ - holo-фермент (полный фермент). Без σ -фактора это core-фермент (2α)ββ’.

σ (сигма) - фактор - сменный фактор специфичности.

Только holo-фермент обладает высоким сродством к специфической последовательности нуклеотидов - промотору, сродство к остальным случайным последовательностям ДНК у него снижено в 10000 раз. У соге-фермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.

Сам по себе σ - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным сродством к промотору.

Как только произошла инициация транскрипции, σ - фактор отделяется. Элонгация - продолжение синтеза РНК, и терминация - его остановка, осуществляются core-ферментом.

Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.

Две α субъединицы - каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субъединицы.

β - субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.

В β - субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой - за элонгацию. Один центр работает в holo-, а другой - в core- ферменте.

Понятие об опероне.

Определение: оперон - единица транскрипции у прокариот,

В начале каждого оперона находится промотор. В конце каждого оперона находится терминатор. Перед терминатором располагаются структурные гены, или цистроны. Между промотором и цистронами может находиться оператор. Существуют моно-, олиго- и полицистронные опероны.

Определение: промотор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как посадочная площадка и старт синтеза РНК.

Только с промотора может начаться синтез специфической РНК.

Определение: терминатор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как финиш транскрипции.

Определение: цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну tPHK, или одну rРНК.

В большинстве случаев цистроны объединяются в оперон по следующему принципу: закодированные в них белки принимают участие в одной биохимической цепи реакций.

Определение: оператор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая белком-репрессором.

У оператора диспетчерская функция - он разрешает или запрещает синтез РНК.

Асимметричность.

Транскрибируются обе цепи ДНК, но в каждом отдельном опероне только одна из них. Какая именно, определяется положением промотора и терминатора.

Особенности структуры промотора

Для изучения структуры промоторов провели следующий эксперимент. При оптимальных условиях связывания получили комплекс РНК-полимеразы с ДНК. Этот комплекс обработали ДНК-азой, и таким образом гидролизовали всю ДНК, незащищенную РНК-полимеразой. После этого отделили РНК-полимеразу от оставшихся фрагментов ДНК. Опять создали оптимальные условия для образования комплекса. Комплекс не образовывался.

Отсюда следует вывод, что узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК.

Эти участки отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. У большинства из них имеется общее свойство.

РНК-полимераза узнает промотор, покрывая 40-60 пар нуклеотидов. В промоторе узнается взаимное расположение двух расплавленных АТ-богатых участков. В каждом из них расплавлении 4-6 пар. Центры этих участков находятся в положениях "-10" и "-35". Принципиально важным является расстояние между расплавленными участками. Оно колеблется от 16 до 19 п.н. Искусственное увеличение этого расстояния до 20 п.н. или уменьшение его до 15 п.н. приводит к тому, что РНК-полимераза не узнает испорченный промотор.

Лекция 7. Регуляция транскрипции у прокариот.

Схема негативной индукции Жакоба и Моно

Lаc-оперон Е. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков, участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.

Z - β - галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).

Y- β - галактозидпермеаза(переносит лактозу через мембрану клетки).

А - пшогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).

В отсутствие в
клетке лактозы
lac-оперон выклю-чен. Активный белок репрессор,
кодируемый в
моноцистронном
oпероне (LacI) ,
не имеющем опера гора, связан опертором lac-оперона. Поскольку опера-тор перекрывается с промотором, даже посадка РНК-полимеразы на промотор невозможна.

Как только некоторое количество лактозы попадает в клетку, две молекулы субстрата (лактозы) взаимодействуют с белком - репрессором, изменяют его конформацию - и он теряеет сродство к оператору.

Тут же начинается транскрипция Laс-оперона и трансляция образующейся mРНК; три синтезируемых белка участвуют в утилизации лактозы.

Когда вся лактоза переработана, очередная порция репрессора, свободного от лактозы, выключает Laс-оперон.

Схема негативной репрессии.

Оперон синтеза триптофана у Е. coli.

В опероне имеется 5 цистронов, которые кодируют ферменты последовательной цепи реакций синтеза триптофана. В норме оперон включен. Белок репрессор неактивен (в форме апо-репрессора), он не способен садиться на оператор.

Клетке нужно N молекул триптофана. N+1-ая молекула взаимодействует с апорепрес-сором. Он меняет конформацию, садится на оператор и синтез РНК прекращается.

Схема регуляции – негатив-ная репрессия, потому что белок репрессор "выключает" оперон.

Помимо "грубой схемы" включения - выключения, есть и тонкая регуляция синтеза триптофана – аттенуация ( см. лекцию N 9).

Схема позитивной индукции Arа-оперон Е. coli.

В нем 3 цистрона, которые кодируют ферменты, расщепляющие сахар арабинозу. В норме оперон закрыт. Белок - репрессор связан с оператором.

Когда в клетку попадает
арабиноза, он взаимодействует с белком - репрессором. Белок репрессор меняет конформацию и превращается из репрессора в активатор, взаимодействующий с промо-тором и облегчающий посадку РНК-полимеразы на промотор.

Эта схема регуляции называется позитивной индук-цией, поскольку контролирующий элемент - белок - активатор "включает" работу оперона.

Схема позитивной репрессии.

Оперон синтеза рибофлавина у Bacilus subtilis.

В опероне располагаются цистроны ферментов синтеза рибофлавина. Есть белок-активатор, обеспечивающий посадку РНК-полимеразы на промотор. В норме оперон открыт. Образуется N молекул рибофлавина.

N+1-ая молекула (лишняя) взаимодействует с активатором и он теряет способность активировать посадку РНК-полимеразы на промотор.

Позитивная репрессия, поскольку в регуляции участвует белок -активатор, а сама регуляция заклю-чается в выключении транскрипции.

Эта схема называется так потому, что контролирующим транскрипцию фактором является негативный фактор, "выключатель" - белок -репрессор. Индукция (включение) происходит при потере сродства белка - репрессора к оператору.

Существует и позитивная регуляция работы Lас-оперона Е. coli.

Позитивный контроль работы Lаc-оперона.

Lac-оперон, подчиняющийся схеме негативной индукции, имеет и позитивный контроль.

цАМФ образуется из АТФ ферментом аденилатциклазой. Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ. Глюкоза активирует второй и инактивирует первый фермент.

Чем больше в клетке глюкозы, тем меньше цАМФ.

Если нет глюкозы, то цАМФ соединяется с белком катаболической репрессии (САР) и образуется комплекс САР-цАМФ, активирующий посадку
РНК-полимеразы на промотор. В присутствии лактозы Laс-оперон включается и работает.

Если же в клетке есть еще и глюкоза (более экономичный источнок энергии), то нет цАМФ - и активатор не образуется, Lac-оперон работает "вяло", без дополнительной индукции.

Лекция 8. Синтез белка в клетке. Подготовительный этап. Структура рибосом.

Синтез белка в клетке состоит из двух этапов: рекогниции и собственно синтеза полипептида на рибосоме. Ключевым субстратом рекогниции является транспортная РНК.

Структура транспортной РНК.

Транспортные РНК (tPHK) - короткие молекулы (70-90 нукл.), имеющие и вторичную, и третичную структуру.

Вторичная структура - "клеверный лист". Последовательность ССА на 3'-конце одинакова для всех tPHK. К концевому аденозину (А) присоединяется аминокислота.

Наличие в tPHK тимина (Т), псевдоуридина (ψ) (в ТψС- петле ), и дигидроуридина (ДГУ) (в D-петле) - минорных, т.е. редко встречающихся в РНК нуклеотидов, указывает на особенности ее строения, необходимые для безошибочного узнавания ферментами, для защиты от действия рибонуклеаз (поэтому tPHK - долгоживущие, в отличие от тРНК).

Третичная структура в проекции на плоскость имеет форму бумеранга.

Разнообразие первичных структур
tРНК – 61+1 кодонов (соответственно числу
антикодонов в tРНК) формилметиониновая tPHK, у которой антикодон такой же, как у метиониновой tPHK.

Разнообразие третичных структур
- 20 (по количеству аминокислот).

Рекогниция.

Определение: рекогниция - это подготовительный этап трансляции, суть которого в образовании ковалентной связи между tPHK и соответствующей аминокислотой.

Состоит из двух стадий:

1. Активирование аминокислоты.

2. Присоединение аминокислоты к tPHK - аминоацилирование.

Обе стадии рекогниции осуществляются ферментом аминоацил-tРНК-синтегазой (АРС-азой, кодазой). Существует 20 вариантов кодаз (по числу аминокислот). У каждой кодазы 3 центра опознавания. Каждая АРС-аза узнает третичную структуру tPHK.

Определение: tPHK, имеющие разную первичную, но одинаковую третичную структуру, акцептируют одну и ту же аминокислоту и называются изоакцепторными tPHK.

Есть особая tPHK, которая называется формилметиониновой tPHK. Она узнается метиониновой кодазой, соединяется с метионином и уже после реакции аминоацилирования метионин формилируется специальным ферментом, который узнает эту особую форму tPHK.

Именно с формилметионина начинается синтез любого полипептида у прокариот.

Определение: аминоацилирование - это образование связи между аминокислотой и tPHK.

Следующий этап трансляции - собственно синтез полипептидов, происходит на рибосомах.

Структура рибосом.

Рибосомы - немембранные самые мелкие клеточные органеллы, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке Е. coli присутствует около 10³-5x10³ рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290Å. У эукариот - 220 х 320Å.

Выделяют четыре класса рибосом:

1. Прокариотические 70S.

2. Эукариотические 80S.

3. Рибосомы митохондрий (55S - у животных, 75S - у грибов).

4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).

Определение: S - коэффициент седиментации или константа Сведберга. Отражает скорость осаждения молекул или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного веса.

Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).

Сложность объясняется тем, что все элементы рибосом представлены в одном экземпляре, за исключением одного белка, присутствующего в 4 копиях в 50S субъединице, и не могут быть заменены.

rРНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.

23S гРНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S rРНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона mPHK, 5S rРНК - для правильной ориентации аминоацил-tPHK на рибосоме.

Все rРНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.

rРНК в значительной степени метилированы (СН₃-группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).

Порядок сборки субъединиц из rРНК и белков строго определен. Субъединицы, не соединенные друг с другом, представляют собой диссоциированные рибосомы. Соединенные - ассоциированные рибосомы. Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg²⁺ (до 2x10³ ионов на рибосому). Магний нужен для компенсации отрицательного заряда гРНК. Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg²⁺ (в меньшей степени - марганца Мn²⁺).

Каталитические центры рибосом.

Асп - центр специфического

узнавания. Здесь происходит взаимодействие кодон-антикодон.

Р-центр - пептидильный, донорный.

Он является донором формилметио-нина при инициации, или пептидила при элонгации трансляции.

А-центр - аминоацильный, акцепторный.

Акцептирует формилметионин в самом начале или пептидил при элонгации трансляции.

К-центр - каталитический (фермент пептидилтрансфераза). В К-центре задействована 23S гРНК и несколько белков большой субъединицы.

Лекция 9. Синтез белка на рибосоме. Синтез полипептидов на рибосоме.

У прокариот перед каждым геном и соответ-ственно в тРНК перед копией каждого гена имеется лидерная последовательность.

Она может быть разного размера (до
160 нукл.) и разной первичной структуры, но обязательно содержит полипуриновую последовательность Шайна-Дальгарно, которая комплементарна 3'-концевому участку 16S гРНК. Комплементарными могут быть 3-9 нуклеотидов.

Назначение комплементарного взаимодействия3'-концевого участка 16S rРНК и последовательности Шайна-Дальгарно - правильная установка инициирующего кодона AUG на малой субъединице рибосомы.

Инициирующий кодон находится на расстоянии 3-10 нукл. от последова-тельности Шайна-Дальгарно.

К малой субъединице, на которой уже находится mРНК, подходит формилметиониновая tPHK, соединенная с формилметионином. В результате образуется инициаторный комплекс:

30S субъединица рибосомы + тРНК +
формилметионовая tPHK-форлшлметионин.

Затем происходит ассоциация рибосомы. При этом изменяется конформация 16S rРНК и нарушается связь между ней и последователь-ностью Шайна-Дальгарно.

Аминоацильный конец формилметиониновой tPHK оказывается в Р-центре. Второй кодон гена оказывается в Асп-центре. Соответствующая ему аминоацил-tPHK устанавливается таким образом, что ее аминоацильный конец попадает в А-центр.

Пептидилтрансфераза отрывает формилметионин в Р-центре и переносит его в А-центр. Образуется пептидная связь между формилметионином и аминоацил-tPHK.

Рибосома претерпевает конформационные изменения и сдвигается на один кодон. Формилметиониновая rРНК покидает рибосому. Второй кодон оказывается напротив Р-центра. Сюда же переходит tPHK, несущая на хвосте дипептид. В Асп-центр попадает третий кодон, а в А-центр очередная аминоацил-tPHK.

Теперь в Р-центре отрывается дипептид, переносится в А-центр и соединяется с третьей аминоацил-tPHK.

Так продолжается до тех пор, пока в Асп-центр не приходит терминирующий кодон. Полипептид отрывается в Р-центре, переносится в А-центр и, т.к. присоединиться ему не к чему, он отваливается от рибосомы. Рибосома диссоциирует и малая субъединица сканирует mРНК.

In vivo на каждой стадии (образования инициаторного комплекса, инициации элонгации и терминации) участвуют различные белковые факторы, которые препятствуют посадке на рибосому деацилированных rРНК или запрещают посадку формилметиониновой-tPHK в А-центр.

На всех этапах принимают участие молекулы ГТФ, которые дефосфорилируются.

Смысл гидролиза ГТФ не в отдаче энергии, а в свидетельстве того, что данный этап трансляции пройден.

Регуляция образования рибосомных РНК и белков Е.соli.

Ежеминутно в E.coli образуется около 500 рибосом.

Имеется 7 оперонов, в которых закодированы rРНК (всего 3 разных rРНК х 7 оперонов = 21 ген). В формировании рибосом участвуют 52 различных белка, а значит 52 гена, их кодирующих. В итоге, 73 гена должны работать координирование, чтобы не было избытка белков или rРНК.

Вначале образуется про-rPHK, которая метилируется и процессируется (т.е. "созревает").

Количество rРНК регулируется количеством рибосомных оперонов, скоростью ilk транскрипции и работой ферментов метилаз и эндонуклеаз.

Имеется 7 разных оперонов, в которых закодированы рибосомные белки. Регуляция каждого из них осуществляется отдельно.

α-оперон регулируется белком S4.

Если в клетке имеется свободная 16S rРНК, то S4 связывается с ней (1). Если же 16S rРНК не хватает, то он связывается с mРНК,
считывающейся с данного оперона (2). Причем связывается в районе лидера и тем самым мешает трансляции.

Таким образом, осущес-твляется регуляция на уровне трансляции.

Оперон S10 регулируется белком L4.

РНК-полимераза синтезирует первую лидерную последо-вательность, длиной 140 нукл. Если 23S rРНК не хватает (2), то белку L4 не с чем соединяться, и он взаимодействует с лидер-ной последовательностью, придавая ей такую кон-формацию, которая не позволяет РНК-полимеразе продолжать транскрипцию. В результате синтез тРНК обрывается на первом же лидере (2).

Регуляция на уровне транскрипции.

Оперон σ.

В этом опероне закодированы белки, имеющие принципиальное значение для инициации транскрипции (σ - фактор), инициации репликации (dna G -праймаза) и инициации трансляции (белок S21). Каждый белок нужен в разном количестве. S21 ~ 50000 копий, dnaG - 50, СГ- фактор ~ 5000. Между геном S21 и геном dnaG есть слабый терминатор транскрипции. Ген dnaG имеет инициирующий кодон ГУГ (а не АУГ), который гораздо хуже узнается рибосомой и реже, чем АУГ инициирует трансляцию.

Аттенуация (ослабление).

Рассмотрим систему аттенуации на примере триптофанового оперона E.coli.

Этот оперон регулируется по схеме негативной репрессии.

При недостатке в клетке триптофана оперон открыт. При увеличении концентрации триптофана РНК-полимераза не доходит даже до первого цистрона.

Между оператором и первым цистроном есть протяженный участок (162 п.н.), который содержит последовательность Шайна-Дальгарно. Она расположена ближе к цистрону, все остальное же представляет собой аттенуатор.

В этом районе происходит прекращение транскрипции и отсоединение РНК-молимеразы от ДНК. Это сделано для того, чтобы остановить РНК-полимеразу, которая уже в пути, в том случае, если концентрация триптофана в клетке к этому моменту повысилась.

В аттенуаторе выделяют 4 последователь-ности, частично комплементарные друг другу. В последовательности 1 закодирован 14-и членный пептид (Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser). На 10-ом и 11-ом месте в нем стоит триптофан.

Если триптофан в клетке есть и доступен, то рибосома с легкостью преодолевает участок 1 и стерически мешает образованию шпильки (2)-(3). Тогда образуется шпилька (3)-(4), которая узнается РНК-полимеразой как сигнал прекращения транскрипции. Синтез mРНК обрывается.

Если триптофан недоступен, то рибосома застревает на участке 1 и образуется шпилька (2)-(3). В этом

случае не может образоваться шпилька (3)-(4). Сигнала для прекращения синтеза mРНК нет.

Все синтезируемые полипептиды прока-риот на N-конце несут формилметионин. В 20% случаев он отщепляется, а в 80% отщеп-ляется только формильная группа и на N конце остается метионин.

Лекция 10. Транскрипция у эукариот.

У эукариот процессы транскрипции и трансляции разобщены во времени и пространстве (транскрипция - в ядре, трансляция - в цитоплазме),

У эукариот существуют специализированные РНК-полимеразы. В ядре выделяют 3 типа РНК-полимераз: РНК-полимераза I - синтезирует rРНК (кроме 5S rРНК). РНК-полимераза II - синтезирует mРНК и некоторые sPHK. РНК-полимераза III - синтезирует tPHK, некоторые sPHK и 5SrPHK.

РНК-полимеразы различаются количеством субьединиц, их амино-кислотным составом, и зависимостью от катионов магния и марганца. Для РНК-полимераз I и III необходимое для работы соотношение [Mn²⁺]/[Mg²⁺] = 2. Для РНК-полимеразы II - [Mn²⁺]/[Mg²⁺] = 5.

Наиболее яркое различие - чувствительность к α- аманитину (токсину бледной поганки). Он полностью подавляет работу РНК-полимеразы II в концентрации 10^{-8 М и РНК-полимеразы} III ( в концентрации ^{10-6 М). РНК-полимераза} I фактически нечувствительна к этому токсину.

Помимо ядерных РНК-полимераз у эукариот есть еще РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Они кодируются в ядре, а не в соответствующих органеллах.

В органеллах образуются свои tPHK, rРНК и рибосомные белки.

Как образуются рибосомы у эукариот

Гены rРНК присутствуют в количестве от 10 до 10⁵ копий у разных видов (10⁵ у амфибий). У человека - 300 генов, в которых закодированы rРНК.

Все рибосомные гены, кроме генов 5S рибосомной РНК, сближены (т.е располагаются один за другим) и образуют несколько кластеров. Сначала синтезируется про-rРНК, после созревания которой образуются 28S, 18S и 5,8S rРНК.

Интерфазные хромосомы в световой микроскоп не видны. Каждый ген прорибосомной РНК транскрибируется одновременно несколькими РНК-нолимеразами и тут же начинается процессинг.

На электронномикроскопических фотографиях видна картина "рождест-венской елочки". Синтезируемые в ядре mРНК поступают на готовые рибосомы в цитоплазму, где синтезируются рибосомные белки, которые идут в ядро и путаются в "ветвях елки".

Образуются рибосомные субъединицы. Одновременно в эукариотическом ядре находятся сотни тысяч субъединиц рибосом.

Определение: ядрышко - место образования субъединиц рибосом, наблюдаемое в световой микроскоп.

В ядре может быть несколько ядрышек.

Определение: мастер генов rРНК называют ядрышковым организатором.

Особенности транскрипции эукариот.

Единицей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у прокариот.

Оператор, как таковой, отсутствует. Промотор есть, но он организован иначе.

На расстоянии -25 п.н. от +1 нукл. находится ТАТА-бокс. Его позиция определяет точку инициации транскрипции. А на расстоянии -60-80 п.н. находится ЦААТ-бокс, который не является абсолютно необходимым, но присутствует перед большинством генов.

Расстояние между ЦААТ и ТАТА большое и РНК-полимераза не способна накрыть всю эту область.

ЦААТ опознается своим белком, а ТАТА - своим.

Помимо этих есть еще несколько белков, называемых базальными факторами транскрипции.

Определение: базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции.

Базальные факторы транскрипции необходимы для инициации транскрипции всеми тремя ядерными РНК-полимеразами.

Для любого гена, кодирующего белок, есть энхансеры (усилители).

Определение: энхансеры - последовательности ДНК, усиливающие транс-крипцию при взаимодействии со специфическими белками.

Энхансеры - это не непрерывные последовательности нуклеотидов.

Существуют так называемые модули - это отдельные части энхансеров. Одинаковые модули могут встречаться в разных энхансерах. Для каждого энхансера набор модулей уникален. Модули - это короткие последовательности, не более 2-х витков спирали (20 п.н.), которые могут находиться перед, за и даже внутри гена.

Таким образом, М1+М2+МЗ+М4 - один энхансер, но он состоит из 4-х
модулей. Все 4 модуля узнаются своими белками, а они, сидя на ДНК,

взаимодействуют друг с другом. Если в клетке присутствуют все соответствующие белки, то участку ДНК придается определенная конформация и начинается синтез mPHK.

Все соматические клетки многоклеточного эукариотического организма имеют абсолютно одинаковый набор генов. Почему же клетки дифференцированы и специализированы?

Дело в том, что все гены работают на фоновом уровне и не имеют фенотипического проявления. Экспрессируются лишь те гены, у которых все энхансерные модули узнаны своими белками и эти белки взаимодействуют друг с другом. Кроме энхансеров есть сайленсеры (ослабители).

Определение: сайленсеры – последовательности ДНК, ослабляющие транскрипцию при взаимодействии с белками.

При соответствующем наборе белков экспрессия отдельных генов в клетке может быть подавлена.

Лекция 11. Процессинг mРНК

Процессинг (созревание) rРНК и tРНК у эукариот принципиально не отличается от такового у прокариот.

Процессинг mРНК отличается сильно и состоит из нескольких этапов.

1. Кепирование 100% mРНК

2. Полиаденилирование ~95% mРНК

3. Сплайсинг ~ 95% mРНК. Сплайсингу подвергаются только полиаденилированные mРНК.

4.Редактирование Показано лишь для нескольких mРНК.

Все стадии процессинга mРНК происходят в РНП-частицах (рибонуклеопротеидных комплексах).

По мере синтеза про-mРНК, она тут же образует комплексы с ядерными белками - информоферами. И в ядерные, и в цитоплазматические комплексы mРНК с белками (информосомы) входят sРНК.

Таким образом, mРНК не бывает свободной от белков.

На всем пути следования до завершения трансляции mРНК защищена от нуклеаз. Кроме того, белки придают ей необходимую конформацию.

Определение: полисома - комплекс mРНК с несколькими или многими рибосомами.

В составе информосом mРНК может жить от нескольких минут до нескольких дней, не подвергаясь действию нуклеаз. (Так, mРНК живут неделями в ооцитах, предшественниках яйцеклеток).

Кепирование

Кепирование - надевание "шапочки".

"Сар" представляет собой метилированный ГТФ, присоединенный в необычной позиции 5'-5' и две метилированные рибозы в первых двух нуклеотидах mРНК. По мере образования про-mРНК (еще до 30-ого нуклеотида), к 5'-концу, несущему пуринтрифосфат, присоединяется гуанин, после чего происходит метилирование.

ГТФ + гуанинтрансфераза (Е) Е~фГ + ф-ф

5'ф-ф-ф-Пур-ф-Х-ф-Y-ф-Z-...+E~фГГ5'-ф-ф-ф-5'-Пур-ф-Х-ф-Y-ф-Z... (метилирование) Г_m-ф-ф-ф-Пур_m-ф-Х_m-ф-Y-ф-Z-...

Назначение "Сар"

1. Защита 5'-конца mРНК от действия экзонуклеаз.

2. За счет узнавания "Сар"-связывающими белками происходит правильная установка mРНК на рибосоме.

Полиаденилирование

Когда синтез про-mРНК завершен, то на расстоянии примерно 20 нуклеотидов в направлении к 3' - концу от последова-тельности 5'-AAУAA-3' происходит разрезание специфической эндонуклеазой и к новому 3'-концу присоединяется от 30 до 300 остатков АМФ (безматричный синтез).

Каждый вид mРНК имеет "поли-А хвост" определенной длины. Он защищает 3'-конец от гидролиза, т.к. покрыт полиА-связывающими белками.

В значительной степени время жизни mРНК коррелирует с длиной полиА-хвоста.

mРНК ряда генов не полиаденилируется (например гистоновых генов).

Полиаденилированные про-mРНК подвергаются сплайсингу.

Сплайсинг

В 1978г. Филипп Шарп (Массачусетский технологический институт) открыл явление сплайсинга РНК (от англ. to splace - сшивать без узлов).

Определение: экзоны - кодирующие участки генов.

Определение: интроны - некодирующие участки генов.

На долю интронов приходится в 5-7 раз больше нуклеотидных пар, чем на долю экзонов. Количество экзонов в гене больше, чем интронов.

Определение: сплайсинг - вырезание копий интронов из про-mРНК и сшивание копий экзонов с образованием mРНК.

Копии интронов гидролизуются до нуклеотидов.

Сплайсинг показан для большинства mРНК и некоторых tРНК. У простейших найден автосплайсинг rРНК. Сплайсинг показан даже для археобактерий.

Не существует единого механизма сплайсинга. Описано по крайней мере 5 разных механизмов.

В ряде случаев сплайсинг осуществляют ферменты-матюразы.

В некоторых случаях в процессе сплайсинга участвуют sРНК.

В случае автосплайсинга процесс происходит благодаря третичной структуре про-РНК.

Для mРНК высших организмов существуют обязательные правила сплайсинга:

Правило 1. 5' и 3' концы интрона очень консервативны: 5'(ГT-интрон-AГ)3' .

Правило 2. При сшивании копий экзонов соблюдается порядок их расположения в гене, но могут быть выброшены некоторые из них.

Представление об интроне, как пустой, ничего не кодирующей последовательности, неверно. Некоторые интроны кодируют ферменты-матюразы, вырезающие копии этих интронов. На вопрос, зачем эукариотическим геномам экзон - интронная структура, можно ответить только в единичных случаях. Почему эукариотические гены "разорваны", будет рассмотрено в конце курса.

Альтернативный сплайсинг mРНК кальцитонинового гена у млекопитающих (крыса)

Во всех клетках есть кальцитониновый ген, но в клетках щитовидной железы он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, а в клетках гипофиза - нейропептида CGRP (пептида, имеющего отношение к гену кальцитонина). Ген один, а белки получаются разные в результате сплайсинга mРНК и процессинга полипептидов. В клетках других тканей этот ген не экспрессируется.

Сплайсинг осуществляется белковыми комплексами - сплайсосомами, в которых помимо ферментов, вырезающих и сшивающих участки про-mРНК, имеются белки, придающие про-mРНК нужную конформацию, и несколько sPНК. Сплайсосома непосредственно связана с ферментами, занимающимися полиаденилированием.

Автосплайсинг

Автосплайсинг открыт Томасом Чеком (США) в 1982 году.

Он работал с инфузорией Tetrаchymenа thermophyla. У этой инфузории образуется 35S про-rРНК длиной 6400 нуклеотидов. Без участия дополнительных соединений белковой природы из этой про-rРНК вырезается внутренний участок длиной в 414 нуклеотида. Два экзона сшиваются с образованием 26S rРНК. Единственное требование - определенная концентрация ионов магния. Про-rРНК имеет третичную структуру и обладает каталитичекой активностью. Впервые было показано, что каталитической активностью обладают не только белки.

Определение: РНК-зимы - РНК с каталитической активностью.

Сегодня описано несколько десятков РНК-зимов.

Малые РНК

sРНК обнаружены в количестве 10³-10⁵ копий на клетку. Поскольку в большинстве случаев эти РНК обогащены урацилом, они называются U1, U2... Их размер от 100 до 300 нукл. Все они кодируются в ядре, но работают как в ядре (small nuclear - S_N), так и в цитоплазме (small cytoplasmic - S_C).

SNURPS - РНП (рибонуклеопротеидные комплексы) в ядре. snРНК входят в состав РНП, участвующих в полиаденилированиии и сплайсинге.

SCURPS - РНП в цитоплазме. Входят в состав информосом.

Малая РНК U4 присутствует в комплексах, участвующих в полиаденилировании. Если получить антитела к белкам, связывающимся с U4, то не происходит полиаденилирования и сплайсинга.

При красной волчанке (аутоимунном заболевании) вырабатываются антитела к белкам комплекса с U4.

Гистоновая mРНК не полиаденилируется потому, что sРНКU7, которая комплементарна 3'-концу гистоновой mРНК, защищает ее от полиаденилирования.

Малые РНК U1, U2, U4, U5, U6 входят в состав сплайсосомы.

Редактирование

Определение: редактирование - изменение генетической информации на уровне mРНК.

Трипаносома - одноклеточный паразит, вызывающий у человека сонную болезнь. В клетке трипаносомы есть митохондрии и множество ферментов окислительного фосфорилирования. Один из ключевых ферментов - цитохромоксидаза. Он имеет четвертичную структуру и состоит из 3-х разных субъединиц.

Человек (постоянный хозяин трипаносомы) теплокровен, поэтому трипаносоме не нужна энергия собственных митохондрий. Синтезируются только две субъединицы цитохромоксидазы.

Муха цеце (промежуточный хозяин трипаносомы) - холоднокровна. Трипаносоме нужен работающий фермент. Все три субъединицы синтезируются.

В геноме трипаносомы только два гена для двух субъединиц. В mРНК одного из них происходит разрезание и встраивание 4-х урацилов (на небольшом расстоянии друг от друга, но не подряд).

Происходит сдвиг рамки считывания и отредактированная mРНК кодирует новый полипептид - третью субъединицу цитохромоксидазы.

Лекция 12. Репликация. Принципы. Синтез ДНК in vitro

Репликация ДНК

Определение: процесс, осуществляемый комплексом ферментов и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов, называют репликацией ДНК.

Принципы репликации

1. Комплементарность.

2. Антипараллельность.

3. Униполярность.

4. Потребность в затравке.

5. Прерывистость.

6.Полуконсервативность.

Первые три принципа можно сформулировать в одной фразе:

Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5'→ 3'.

Доказательство полуконсервативного характера репликации

Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. .

ДНК разделяется не по молекулярным весам, а по удельной плотности.

E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N₁₅), для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки синхронизировали. При этом в среде заменяли N₁₅ на легкий изотоп N₁₄ с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl.

Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.

Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая - вновь синтезированную, обе цепи которой являются новыми.

Клетки второго поколения содержали как полностью "легкие" молекулы, так и "гибридные", состоящие из одной "легкой" и одной "тяжелой" цепи, аналогичные молекулам первого поколения. Этот факт исключал возможность дисперсного механизма, согластно которому куски материнской ДНК случайным образом распределяются между дочерними молекулами.

Ферментативная система синтеза ДНК in vitro

В 1956 г. Артур Корнберг наработал 100 кг биомассы E. coli и выделил 0.5 г фермента ДНК-полимеразы.

Необходимые компоненты для синтеза ДНК in vitro:

1. ДНК-матрица - образец, по которому строится новая цепь ДНК.

2. Активированные нуклеотиды (dАТФ, dГТФ, dТТФ, dЦТФ) - то, из чего строятся дочерние цепи.

3. ДНК-полимераза - то, что строит новую цепь ДНК.

4. Ионы магния - то, без чего фермент не работает.

ДНК-матрицу необходимо активировать.

Нативная двуцепочечная ДНК, не имеющая повреждений, не может эффективно использоваться в этой системе. Активировать ее можно либо денатурацией щелочью или нагреванием (1), либо обработкой экзонуклеазой III из E. сoli (2), либо внесением ников (одноцепочечных разрывов) с помощью эндонуклеаз (3).

Понятие о матрице и затравке

Продукты, образуемые в ферментативной системе in vitro.

Во всех случаях матрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.

В том случае, если эндонуклеаза вносила ники с 3'-фосфатным концом, ДНК не являлась активированной.

Прямым доказательством того, что затравка - 3'-гидроксильный конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом.

Если такой активированный нуклеотид сделать меченым по α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет 3'-гидроксильного конца.

Это также доказывает и униполярность репликации в направлении 5' →3'.

Строение и свойства ДНК-полимеразы Корнберга (ДНК-полимеразы I)

ДНК - полимераза Корнберга (ДНК-полимераза I) - это одна полипептидная цепь с молекулярным весом 109 тыс.

В состав полимеразы входят ионы цинка. Она абсолютно зависима от ионов магния.

Обнаружено 4 разные каталитические активности ДНК - полимеразы I:

1. Полимеризационная в направлении 5`→3`.ДНК_n+dХТФ →ДНК_n+1 + Ф-Ф

2. Пирофосфоролиз: ДНКn+Ф-Ф*ДНК_n-1 + dХТФ* Эта активность возможна при большом избытке пирофосфатов.

3.Пирофосфатный обмен: ДНК_n + dХТФ + Ф-Ф*→ДНК_n+ dХТФ* + Ф-Ф
Фермент работает только тогда, когда он находится на молекуле ДНК и имеет соответствующую конформацию.

4.Гидролитическая активность: ДНК_n + Н₂О→ДНК_n-1 + dХMФ
Эта активность имеет большой биологический смысл. Гидролитическая активность проявляется в направлении 3'5' и 5'3'.

Активность 3' 5' проявляется на неспаренном 3'-гидроксильном конце. Фермент возвращается при ошибке включения и "откусывает" неправильный нуклеотид.

Это корректорская функция фермента.

Все ДНК-полимеразы обладают этой активностью.

Фермент способен гидролизовать спаренный 5'-конец, расчищая себе дорогу и продолжая полимеризацию.

Если на пути фермента встречается короткий (меньше 10 нуклеотидов) неспаренный 5'-конец, то полимераза сначала проявляет эндонуклеазную активность и откусывает весь свисающий конец, а затем проявляет экзонуклеазную 5'3' активность т.е. откусывает по одному нуклеотиду.

Если неспаренный 5'-конец длинный, то фермент использует его как матрицу.

Примягком расщеплении ДНК-полимеразы трипсином можно получить два активных фрагмента: один обладает полимеразной и 3'→5' гидро-литической активностью (фрагмент Кленова), другой - 5'3' гидролитической активностью

Лекция 13. Схемы репликации ДНК in vivo

Схема непрерывной антипараллельной репликации in vivo по Корнбергу

1960г. Гипотетическая модель.

Суть предположения: неизвестный фактор денатурирует концы линейной молекулы, 3'-ОН-концы загибаются и служат затравками для работы ДНК-полимеразы. Фермент осуществляет денатурацию матричной ДНК по мере продвижения и синтеза дочерних цепей. На выходе - дочерние молекулы, которые короче на загнутый конец, т.к. эндонуклеаза вносит разрыв в материнскую цепь.

Схема непрерывной параллельной репликации Джона Кэрнса

1963г. Авторадиография

Бактерии выращивались на среде с радиоактивным H₃-тимидином в течение 5-и, 10-и, 15-и мин., после чего проводили авторадиографию.

Ширина полос засветки соответствовала двум меченым нитям ДНК (если помечена одна цепь, то полоса будет получаться уже).

В модели допускалось наличие фермента, способного вести синтез в направлении 3' 5'. Такой фермент не найден и сегодня.

Модель неверна, однако, она побудила искать новые ДНК-полимеразы и в Е. coli были найдены еще две: II и III.

Сравнительные характеристики ДНК-полимераз E. сoli

Функция	ДНК-полимераза I	ДНК-полимераза II	ДНК-полимераза III
Полимеризация в 5' 3' направлении	+	+	+
Гидролитическая активность 3' 5'	+	+	+
Гидролитическая активность 5' 3'	+	-	-
Потребность в матрице-затравке:
Нативная двуцепочечная ДНК	-	-	-
Одноцепочечная ДНК с олигонуклеотидной затравкой	+	-	-
2-х цепочечная ДНК с ником	+	-	-
или с пробелом меньше 100 нуклеотидов	+	+	+
или с пробелом больше 100 нуклеотидов	+	-	-
Оптимальная концентрация KCl	Активность
20мМ	60%	60%	100%
50мМ	80%	100%	50%
100мМ	100%	70%	10%
150мМ	80%	50%	0%
Влияние 10% этанола	40%	45%	200%
Молекулярный вес (кДа)			субъединич.состав
Число оборотов, принимая за единицу 667 нукл/мин.		0.05
Число молекул на клетку

К репликации имеют отношение полимеразы I и III.

Причем именно полимераза III является репликазой, т.е. она синтезирует in vivo новые цепи ДНК.

Участие ДНК-полимеразы I необходимо. У нее вспомогательная, репаративная функция.

ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации.

Схема прерывистой антипараллельной репликации Рейджи Оказаки

1968 г.

Исходные посылки: все данные Корнберга, полученные в ферментативной системе in vitro, и "картинки" Кэрнса верны ( но картинки неправильно интерпретированы).

Оказаки специально разработал два новых метода исследования.

1. Метод импульсного мечения. До Оказаки метку давали в культуральную среду и быстро начинали отмывать клетки, но минимальное время подачи метки было 5 мин. Оказаки через нужный момент времени после добавления меченого тимидина давал 1000-кратный избыток холодного (немеченого) тимидина. Таким образом, метка включается только в течение очень короткого времени.

Оказаки считал, что время Кэрнса (5 мин.) очень велико для получения истинной картины происходящего при репликации.

2. Центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.
Сахароза разводится на щелочи. В щелочной среде происходит денатурация ДНК. В этом случае короткие фрагменты ДНК, если они есть, отделяются от длинных. После этого их можно выявить при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы, разделяющем молекулы по молекулярному весу.

Оказаки предположил, что синтез ДНК идет короткими фрагментами и что короткие фрагменты должны сшиваться.

Сшиваются они лигазой. ДНК-лигаза была обнаружена как у прокариот, так и у эукариот. У E. сoli были найдены мутанты по лигазе.

Оказаки провел эксперимент на бактериях, зараженных фагом Т4, у которого есть своя термочувствительная лигаза, которая работает при 20С и не работает при 43С. Если в клетку попадает фаговая ДНК, то клетка переключается на репликацию ДНК фага.

Клетки заражали фагом Т4, давали импульсную метку Н₃-тимидин и выращивали при двух температурах: 20С и 43С. Потом проводили центрифугирование в щелочном градиенте сахарозы.

Лигаза E. coli нуждается в коферменте НАД, а лигаза фага - в АТФ. Если E.coli не давать никотиновую кислоту (предшественник НАД), бактериальная ДНК реплицируется, но не сшивается.

Прерывистость репликации показана для всех объектов, кроме фагов, содержащих одноцепочечную ДНК.

У некоторых фагов и вирусов прерывистый синтез идет по обеим цепям. У бактерий и высших организмов одна цепь образуется непрерывно, а другая - прерывисто (лидирующая и запаздывающая цепи).

Размер фрагментов Оказаки видоспецифичен и составляет для фагов 1000-2000 нукл., E. сoli - 1000 нукл., для эукариот - 200-400 нукл.

У фага Т7 обе цепи ДНК тоже реплицируются прерывисто. Они имеют разную плотность (в одной больше пуринов). Цепи были разделены в градиенте плотности CsCl и помещены на две колонки. Была осуществлена ковалентная привязка, поэтому они не могли сойти со смолы. Потом провели репликацию в условиях импульсного мечения. Пропустили все фрагменты через первую колонку. Выход был 50%. Остальные прогнали через вторую колонку. Выхода не было. Таким образом, было показано, что фрагменты комплементарны обеим матричным цепям. Значит, фрагменты образуются по обеим цепям

Схема размножения фага М13

1974 г. Оказаки.

Рифампицин - ингибитор бактериальной РНК-полимеразы (на стадии инициации).

Хлорамфеникол - ингибитор трансляции на бактериальных рибосомах.

Если одновременно с заражением E. сoli фагом добавить хлорамфеникол, то блокируются трансляция, репликация II и сборка фагов.

Если подействовать рифампицином, то блокируется не только транскрипция и все следующие процессы, но и репликация I.

Вывод: бактериальная РНК-полимераза участвует в репликации ДНК фага.

Вся фаговая ДНК составляет ~6000 нукл.

Определение: origin (ori) - район начала репликации.

В районе ori (начало репликации) имеется 4 шпильки. Эти шпильки опознаются РНК-полимеразой, и вторая шпилька используется в качестве матрицы. По мере образования РНК шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24 нукл., 3'-конец которой используется ДНК полимеразой III.

Когда 3'-конец синтезируемой цепи ДНК "утыкается" в 5'-конец РНК-затравки, ДНК-полимераза III вытесняется ДНК-полимеразой I, которая, обладая 5'→3' гидролитической активностью, "съедает" РНК-затравку, одновременно продолжая синтез ДНК. Когда затравка (РНК) съедена, ДНК-полимераза I вытесняется лигазой, которая сшивает концы ДНК.

Все эти ферменты (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза) входят в состав реплисомы. Они представляют единый белковый комплекс, который реагирует изменением конформации на выполнение очередной функции.

Протяженная (более 100 нукл.) одноцепочечная ДНК-матрица может быть использована ДНК полимеразой III, когда полимераза III представлена в форме holo-фермента. Помимо субъединицы , обладающей полимеразной активностью, в holo-фермент входит еще несколько субъединиц, обеспечивающих высокую процессивность синтеза ДНК.

Фаг X174

Репликация ДНК этого фага не зависит от рифампицина.

Здесь работает не обычная РНК-полимераза, а особый фермент - праймаза. Он умеет делать только РНК-затравку.

Праймаза нуждается в дополнительных факторах - белках препрайминга. Точно так же (с помощью праймазы и белков препрайминга) образуются РНК-затравки при репликации ДНК E. сoli.

Праймосома - это белки препрайминга и праймаза.

Белки движутся по матричной цепи ДНК в 5' 3' направлении, праймаза - в противоположном, синтезируя РНК-затравки в организованных с помощью белков препрайминга участках ДНК на расстоянии ~1000 нукл. друг от друга.

Лекция 14. Топология репликации

Топологические проблемы репликации ДНК

SSB

Белки Альбертса, обнаруженные в 1968г., снижают температуру плавления ДНК in vitro на 20-40С. Они связываются с ДНК электростатически, хотя имеют отрицательный заряд. Эти белки содержат кластер положительно заряженных аминокислотных остатков, но общий заряд белка отрицателен. У них повышенное сродство к одноцепочечной ДНК. Белок не связывается с двуцепочечной ДНК, не имеющей расплавленных участков.

Но если есть одноцепочечная ДНК, то белки легко садятся на нее, выпрямляют ее, превращая ДНК в "палку".

Белки связываются с двуцепочечной ДНК, если в ней есть нарушения вторичной структуры.

Когда в ДНК образуется расплавленный участок, белок покрывает его за счет электростатических взаимодействий. При этом проявляется сродство белков друг к другу. Они покрывают ДНК сплошным слоем (стехиометрическое количество белка).

Белки, сидящие на комплементарных цепях, не дают цепям схлопнуться, т.к. имеют мощный отрицательный заряд. Называются эти белки SSB (single strand bind).

Они не денатурируют ДНК, а лишь фиксируют одноцепочечное состояние.

Участие SSB в репликации абсолютно необходимо. Они удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке в одноцепочечном состоянии, а также защищают одноцепочечную ДНК от действия нуклеаз. Они избирательно стимулируют работу ДНК-полимеразы. РНК-полимераза не может использовать одноцепочечную ДНК, покрытую SSB. Избирательность касается и вида. Например, SSB фага Т4 стимулирует ДНК- полимеразу фага Т4, но не ДНК-полимеразы Е. сoli.

SSB не ферменты - они нужны в стехиометрическом количестве.

Геликазы

В 1974г найдены геликазы.

Определение: геликазы - ферменты, денатурирующие ДНК.

У E.coli есть четыре геликазы: геликаза I, геликаза II, геликаза III и rep-белок.

Rep-геликаза используется при репликациии II одноцепочечных ДНК-содержащих фагов. Для репликации бактериальной ДНК она не нужна.

Геликазы различаются требованиями к размеру посадочной площадки, на которую они садятся для начала движения.

Площадка - это одноцепочечный участок ДНК, т.е. геликаза не может начать плавление нативной ДНК без дефектов.

Как образуется такая площадка в нативной ДНК? Эта проблема решается с помощью топоизомераз.

Топоизомеразы

Определение: топоизомеразы - ферменты, изменяющие топологию ДНК.

Топоизомеразы меняют число зацеплений одной цепи за другую.

Делятся на два класса:

Тип I (релаксазы) - уменьшают число зацеплений.

Тип II (гиразы) - увеличивают число зацеплений.

Гиразы вносят двуцепочечный разрыв ДНК по принципу работы рестриктаз.

Определение: рестриктазы - эндонуклеазы, которые узнают определенные последовательности и делают разрезы в обеих цепях.

После разрыва цепей гираза поворачивает концы ДНК на 360 и проявляет лигазную активность, т.е. сшивает цепи ДНК. В этом процессе используется энергия АТФ. Результат деятельности гираз - супервитки.

Суперспирализованная ДНК напряжена. При высоком напряжении в суперспирали в некоторых местах цепи расходятся, т.к. расплавляются А-Т богатые участки.

Гиразы имеют отношение и к транскрипции, поскольку при напряжении в молекуле ДНК плавятся А-Т богатые районы промоторов, а палиндромы переходят в форму креста.

Все природные кольцевые двуцепочечные ДНК имеют отрицательную суперспирализацию. Один супервиток приходится на каждые 200 пар нуклеотидов.

У релаксаз есть только эндонуклеазная и лигазная активности, но нет АТФ-азной.

Они разрывают только одну цепь. Происходит раскручивание напряженной ДНК, после чего релаксаза сшивает концы. Релаксаза узнает определенную конформацию суперспирализованной молекулы ДНК и режет ее, сбрасывая тем самым лишнме супервитки.

Регуляция транскрипции в бактериальной клетке осуществляется не только на уровне белков репрессоров (активаторов), но и на уровне активности гираз и релаксаз.

Современная схема репликации ДНК E. сoli

Белки, участвующие в репликации ДНК E.сoli.

Название	Мол.вес (кДа)	Число субъединиц	Количество молекул на клетку	Функция
Гираза   gyrA   gyrB				суперскручивание для плавления ori эндонуклеазная и лигазная активности АТФ-азная активность
SSB				Фиксация одноцепочечной ДНК
Геликаза I II III	180 75 56	1 1 1		Плавление ori в репликативной вилке
Белки препрайминга	Препрайминг
priA				3'5' геликаза по запаздывающей цепи, удаляет SSB
dnaT
n
n'				АТФ-аза
n"
dnaC
dna B				5'3' геликаза по запаздывающей цепи
Праймаза dnaG				Синтез РНК-затравок (праймеров)
ДНК-полимераза III	Синтез ДНК
holo-фермент				полимеразная 5'3' активность гидролитическая 3' 5' активность
ДНК-полимераза I				Удаление праймеров и заполнение брешей
Лигаза				Сшивание фрагментов Оказаки

У E.coli один origin репликации и две репликативные вилки. Сегодня популярна модель "тромбона", согласно которой ДНК-полимераза III образует асимметричный димер и одновременно ведет непрерывный синтез лидирующей цепи и фрагментов Оказаки запаздывающей цепи.

Лекция 15. Особенности репликации ДНК эукариот

ДНК у эукариот не кольцевая. Тогда возникает вопрос: как же достигается плавление ori?

У фага Т4 тоже не кольцевая ДНК. Субъединицы гиразы сближают несмежные участки ДНК и образуется петля. В ней и ведется суперспирализация.

У эукариот ДНК закрепляется белками в нескольких местах на ядерной мембране. На каждом отдельном участке работает топоизомераза. Сколько участков, столько и ori Хотя в клетке у человека ДНК на 3 порядка больше чем у E. сoli, время репликации соизмеримо (за счет большего количества ori).

Каждая эукариотическая хромосома - полирепликон.

Определение: репликон - участок ДНК между двумя ori.

Размер фрагментов Оказаки у эукариот меньше (200-400 нукл).
Скорость работы ДНК-полимераз эукариот на порядок ниже, чем у прокариот.

У эукариот РНК-затравки размером 6-10 нукл. удаляются РНК-азой Н (hybrid). Бреши заделываются репарирующими ферментами.

Проблема репликации концов линейных молекул

Модель "заячьи уши".

Работает у ряда вирусов.

Репликация концов ДНК хромосом эукариот

Удаление РНК-праймеров после завершения синтеза линейных ДНК в виде фрагментов Оказаки и заделывание образующихся между фрагментами брешей нуклеотидами ДНК приводит к тому, что дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нукл.).

Образуются 3'-оверхенги, т.е. выступающие 3'-концы материнских цепей. Они узнаются теломеразой - ферментом, содержащим помимо белковой части еще и РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами.

Теломераза последовательно наращивает материнские цепи ДНК повторами, используя 3'-оверхенги в качестве затравок. Образующиеся длинные одноцепочечные концы в свою очередь служат матрицами для синтеза дочерних цепей традиционным репликативным механизмом.

Хромосомы соматических клеток человека фланкированы многократно повторенными гексамерами TTAГГГ, общая длина районов с повторами может достигать 10 тыс. пар нуклеотидов. В комплексе со специфическими белками такие тандемные повторы образуют теломе-ры, защищающие концы ДНК от действия экзонуклеаз, предотвращаю-щие неправильную рекомбинацию и позволяющие концам хромосом прикрепляться к ядерной оболочке.

При каждом раунде репликации происходит укорочение теломер в среднем на 50 пар нуклеотидов. Поскольку теломерные последовательности не являются кодирующими, они выступают в роли буферной зоны - как защита от "проблемы концевой репликации".

Укорочение ДНК в ходе каждого раунда репликации лишь сокращает нетранскрибируемый текст теломеры, но не приводит к утрате смысловых последовательностей - генов и регуляторов их экспрессии.

Регуляция репликации прокариот известна, т.к. известны гены белков регуляции репликации E.сoli и механизмы их включения (выключения). Для эукариот эти механизмы еще не ясны, но известно расписание репликации ДНК по разным хромосомам.

Лекция 16. Репарация.

Причины ошибок при синтезе ДНК

Способность ошибаться заложена в самой структуре фермента.

Скорее всего, ферменты, которые не ошибались, были тупиковыми ветвями эволюции. На первых этапах зарождения жизни разнообразие обеспечивалось только такими ошибками.

In vitro происходит 1 ошибка на 100 тыс. нукл. для средней ДНК-полимеразы.

In vitro можно уменьшить вероятность ошибки до 1 на 1млн. нукл., если добавить SSB, геликазу и лигазу.

Можно и увеличить вероятность ошибки до 1 на 100, если дать неадекватное количество субстрата, а также если добавить ионы серебра, бериллия, меди, кобальта, никеля, свинца. Это происходит из-за конкуренции этих ионов с ионами магния за связывание с ДНК-полимеразой.

Еще один способ повышения количества ошибок - добавление аналогов нуклеотидов. Например бромдезоксиуридина - аналога тимидина.

Это одно из средств борьбы со СПИДом и раком. Аналоги одинаково вредны для всех клеток, однако в пораженных вирусом клетках чаще проходит репликация.

Этапы проверки

Первичный отбор нуклеотидов идет по принципу комплементарности.
Способностью к этому виду отбора обладают все ДНК-полимеразы благодаря полимеризационной 5'3' активности.

Редактирующий отбор. Его проводят все полимеразы благодаря экзонуклеазной активности 3'5'.

Исправление ошибок в уже синтезированной ДНК. Этим занимаются ферменты репарации.

Вероятность ошибок для ферментов вирусов, про- и эукариот

Разницу связывают со скоростью работы фермента. Чем медленней, тем точнее!

Основные репарабельные повреждения в ДНК и принципы их устранения

1. Апуринизация.

Каждая соматическая клетка теряет за сутки около 10000 пуринов и пиримидинов. В ДНК образуются АП-сайты.

Причины апуринизации: изменение рН, ионизирующее излучение, повышение температуры и т.д.

Разрывается N-гликозидная связь между пуриновым основанием и дезоксирибозой. Если бы апуриновые участки не исправлялись, то была бы катастрофа.

Пиримидины тоже могут отщепляться, но скорость этого процесса на два порядка ниже.

2. Дезаминирование.

Аденин превращается в гипоксантин, который образует две водород-ные связи с цитозином. Гуанин превращается в ксантин, который образует водородные связи с тимином. При дезаминировании цитозина образуется урацил. Тимин не может быть дезаминирован (единственный в ДНК). Наличие тимина в ДНК (вместо урацила) позволяет отличать дезаминированнный цитозин (т.е. урацил) от законного урацила, если бы он был в ДНК.

N-гликозилаза - фермент, который узнает дезаминированное основание, разрывает N-гликозидную связь и удаляет неправильное основание.

После этого АП-специфическая эндонуклеаза вносит одноцепочечный разрыв, и фосфодиэстераза отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь размером в один нуклеотид.

У E. coli она заделывается ДНК-полимеразой I, а лигаза сшивает концы ДНК.

У эукариот брешь заделывает ДНК- полимераза .

ДНК - двуцепочечна в отличие от РНК. Наличие второй цепи обеспечивает исправление ошибок. Дезоксирибоза более устойчива, чем рибоза, к действию щелочи, т.е. при рН > 8, ДНК устойчива, а РНК- нет.

3. Тиминовые димеры.

Под действием ультрафио-летого света происходит ковалентное сшивание рядом стоящих пиримидинов. При сшивании тиминов образуется циклобутановое производное, блокирующее репликацию. Фермент фотолиаза - узнает тиминовые димеры и на свету или в темноте образует с ними комплекс. При освещении видимым светом происходит активация фермента, циклобутановое кольцо разрывается, и вновь получаются два тимина. Этот процесс называется фотореактивацией.

И дезаминированные основания, и тиминовые димеры, кроме того, могут удаляться с помощью эксцизионной репарации.
Специфические эндонуклеазы производят одноцепочечные разрезы (инцизия). Затем происходит удаление (эксцизия) нескольких нуклеотидов и заделывание бреши. У E. сoli заделыванием бреши занимается ДНК-полимераза I. Лигаза сшивает цепь. Она же ликвидирует одноцепочечные разрывы, возникающие при действии ионизирующей радиации.

У E.coli эксцизионная репарация осуществляется мультиферментным комплексом, включающим белки uvrA, uvrB, uvrC (ultraviolet repair), которые узнают поврежденный участок и вносят 5'- и 3'- разрывы с разных сторон от него, uvrD - геликазу, которая отсоединяет вырезанный олигомер - 12 нуклеотидов, используя энергию АТФ.

У эукариот существует функциональный (но не структурный) аналог такого мультиферментативного комплекса. О-6-метилгуанинтрансфераза - Фермент-"самоубийца".

Имеется 14 позиций, по которым ДНК метелируется. Гуанин может быть метилирован (по кислороду в 6-ом положении) и в такой форме будет связываться не только с цитозином, но и с тимином. Таким образом, в два шага может произойти замена пары Г-Ц на А-Т. Фермент принимает метильную группу на один из 12 цистеиновых остатков и при этом "гибнет".

Лекция 17. Структура генома

Определение: геном - вся совокупность молекул ДНК клетки (в случае ряда вирусов говорят о геномной РНК).

Существует ядерный геном, митохондриальный геном и геном пластид. Мы будем рассматривать только ядерный геном. Соматические клетки содержат диплоидный (2n) геном, половые - гаплоидный (n).

Размер генома

Прямой корреляции между количеством ДНК и эволюционной продвинутостью организма нет.

Так, например, у малярийного плазмодия 0.06 пг ДНК в ядре, а у амебы 490 пг. Большое количество ДНК не обязательно приносит качественно новую информацию. Амеба пошла на увеличение количества ДНК для увеличения размеров ядра и самой клетки. Генов у нее меньше, чем у плазмодия, но они копированы много раз. У малярийного плазмодия генов больше, чем у амебы, а ДНК меньше для максимальной компактности. Малые размеры ядра и самого одноклеточного организма позволяют ему быть внутриклеточным паразитом.

У африканской двоякодышащей рыбы ДНК в 15 раз, а у амебы в 70 раз больше, чем у человека.

"Избыточность" эукариотического генома

На ~ 10⁶ пар нуклеотидов у бактерий приходится ~5 тыс. генов. На ~10⁹ пар нуклеотидов у млекопитающих ~50 тыс. генов.

Минусы "избыточной" ДНК:

- увеличение времени синтеза ДНК;

- cложнее организовывать удвоение ДНК;

- высокая энергоемкость - на 1 нуклеотид для включения в цепь ДНК нужно затратить ~60 молекул АТФ.

Неопределенное следствие:

- благодаря зависимости размера ядра от количества ДНК происходит увеличение размеров клетки.

Плюсы "избыточной" ДНК:

- возникает возможность создания сложного регуляторного аппарата, позволяющего поднять организм на более высокий эволюционный уровень.

Причины избыточности:

1. Большой размер генов (за счет наличия интронов).

2. Присутствие повторенных последовательностей. Повторяются и гены, и некодирующие участки. У эукариот некоторые последовательности повторены сотни и тысячи раз.

3. Наличие большого числа некодирующих последовательностей, часть из которых выполняет регуляторную функцию при транскрипции, а часть - необходима для компактизации генома.

Компактность генома эукариот

Компактность - другое принципиальное отличие генома эукариот от прокариотического генома.

При средней разнице размеров геномов на 3 порядка, линейные размеры эукариотических хромосом соизмеримы с длиной ДНК прокариот.

Выделяют, по крайней мере, 4 уровня компактизации ДНК. При этом нить ДНК "укорачивается" в 10000 раз.

Это все равно, что нить, длиной с Останкинскую башню (500 м), уложить в спичечный коробок (5см).

Два первых уровня компактизации эукариотического генома обеспечиваются гистонами.

Общая характеристика гистонов

Гистоны - основные белки. Все они обогащены лизином и аргинином - положительно заряженными аминокислотами. Выделяют 5 фракций гистонов.
Нарабатывается их очень много - 60 млн. молекул каждой фракции на клетку.

Все гистоны, кроме Н1, черезвычайно консервативны в эволюционном отношении (у коровы и клевера разница в Н2А всего в одну аминокислоту!).

Следовательно, эти белки выполняют принципиальную функцию, которая у всех эукариот обеспечивается одинаково.

Любая мутация в гистоновых генах летальна.

Н1 - очень вариабельная фракция. Этот гистон различен не только у видов, но даже у одного организма, в зависимости от стадий онтогенеза.

В гистонах лизин и аргинин кластированы. Средняя часть гистона содержит гидрофобные аминокислоты.

Положительно заряженные аминокислоты гистонов обеспечивают электростатические взаимодействия с ДНК.
Центральная часть необходима для взаимодействия гистонов между собой.

Четыре уровня компактизации ДНК

1. Нуклеосомный.

В основе нуклеосомы лежит гистоновый октамер.

Расположение гистонов не случайно. Каждая молекула представлена дважды. Они образуют кор (серцевину) нуклеосомы. На кор наматывается ДНК - 1.75 левых витка спирали.

Определение: нуклеосомой называется повторяющийся структурный элемент хроматина, содержащий гистоновый октамер и ~180 п.н. ДНК.

Непосредственно с октамером контактирует 145 п.н. и 20-30-40 п.н. между нуклеосомными корами.

Нуклеосомный уровень упаковки свойственен всей эукариотической ДНК, он дает укорочение в 7 раз. Диаметр увеличивается с 20 Å до 110 Å. Гистоновые октамеры "скользят" по ДНК.

При репликации снимается и этот уровень компактизации. При транскрипции нуклеосомы сохраняются.

2. Супербидный, или соленоидный.

Фактически обеспечивается Н1 гистоном.

Н1 взаимодействует с октамерами, сближает их, и еще на него наматывется ДНК. Образуется супербид. Происходит сокращение линейного размера ДНК в 6-10 раз. Диаметр увеличивается до 300Å.

Этот уровень компактизации, как и первый, не зависит от первичной структуры ДНК.

3. Петлевой уровень. Обеспечивается негистоновыми белками.

Они узнают определенные последовательности ДНК и связываются с ними и друг другом, образуя петли по 20-80 тыс. п.н.

Петля обеспечивает экспрессию гена, т.е петля является не только структурным, но и функциональным образованием.

Есть участки, в которых нет петель.Укорочение за счет петель проходит в 20-30 раз. Образуются и петлевые домены. Диаметр увеличивается до 700Å.

4. Метафазная хромосома.

Метафазная хромосома уже удвоена. Она состоит из двух хроматид. Каждая из них содержит одну молекулу ДНК. Сюда входят белки ядерной ламины, серия белковых нитей, сопряженных с ядерной оболочкой и пронизывающих все ядро.

Модификации гистонов очень сильно влияют на компактизацию ДНК.

Гистоны могут метилироваться, фосфорилироваться (по серину, треонину, тирозину), т.е. аминокислотные остатки легко модифицируются. Кроме того, возможно алкилирование и ацетилирование гистонов.

Геном высших эукариот А-Т типа (пары А-Т преобладают), низших эукариот - Г-Ц типа. У человека соотношение (Г+Ц)/(А+Т) = 0.45. У разных типов бактерий диапазон соотношения А-Т пар и Г-Ц пар велик.

Чем больше в геноме А-Т пар, тем больше возможностей для изменения вторичной структуры ДНК. При суперспирализации ДНК А-Т богатые участки плавятся в первую очередь.

Лекция 18. Классификация генов в геноме

Основы метода ренатурации ДНК

ДНК обрабатывают ультразвуком. При этом она деградирует на двуцепочечные куски одинакового размера.

Затем смесь денатурируют и медленно охлаждают.

При температуре на 20С ниже, чем температура плавления ДНК, идет восстановление вторичной структуры (ренатурация).

Если последовательности часто встречаются, то они ренатурируют быстрее.

В процессе ренатурации выделяют две стадии:

1. Бимолекулярная стадия нуклеации. Образуется несколько "ядер"- участков спаривания. Описывается реакцией второго порядка (V ~ [Cднк]²).

2. Мономолекулярная стадия замыкания. Скорость реакции пропорционально первой степени концентрации ДНК. Это дальнейшее образование водородных связей - замыкание.

Процесс ренатурации описывается уравнением: ,
где k - константа скорости ренатурации, С - концентрация одноцепочечной ДНК.

В нулевой момент времени .

Тогда .

Если , то , и это полуренатурация.

Таким образом мы получили характеристику для описания разных молекул ДНК или их частей.

По значению можно выделить 3 фракции:

1. Быстрые повторы.

меньше 0,01 .

Частота встречаемости на гаплоидный геном больше 10⁵.

2. Умеренные повторы.

от 0,01 до 1000 .

Частота встречаемости на гаплоидный геном больше 10, но меньше 10⁵.

3. Уникальные последовательности.

больше 1000 .

Частота встречаемости меньше 10 раз на геном.

Есть отдельные последовательности, которые по значению относятся к одному классу, а по частоте встречаемости - к другому. Это - палиндромы. Они ренатурируют мгновенно, т.к. отсутствует поиск комплементарной цепи, а их встречаемость в геноме может быть низка.

Значение у палиндромов такое же, как и у быстрых повторов, а встречаемость, как у уников или умеренных повторов. У некоторых организмов, например, у черепах, 20% ДНК - палиндромы. В среднем у животных от 2% до 12% генома приходится на палиндромы. У растений - от 1% до 4% (у пшеницы 3 млн. обращенных повторов). Они могут содержать от нескольких десятков до десятков тысяч нуклеотидов. Наиболее часто палиндромы встречаются в регуляторных участках генов.

Гены tРНК - часто встречаемые палиндромы.

Быстрые повторы

К быстрым повторам относится сателлитная ДНК.

Особенности:

1. В этой короткой последовательности (6-10 нукл.) отсутствует один из нуклеотидов. Отсюда следует, что эта ДНК не может быть кодирующей, она никогда не транслируется. Встречается в конститутивном гетерохроматине.

Хромосома не гомогенна. В ней чередуются участки гетерохроматина (более плотный) и эухроматина (не плотные участки). В основном гены располагаются в эухроматине. Но встречаются и в гетерохроматиновых районах.

В зависимости от стадий клеточного цикла один и тот же участок хромосомы может быть в состоянинии как гетеро-, так и эухроматина. Такие участки хромосом называют факультативным гетерохроматином.

Участки, которые всегда уплотнены - конститутивный гетерохроматин. В нем, как правило, генов нет.

2. Сателлитная ДНК обязательно располагается в центромерном районе.

В местах расположения сателлитной ДНК возможна максимальная компактизация. В конститутивном гетерохроматине все четыре уровня упаковки ДНК представлены даже в интерфазе.

По сателлитной ДНК происходит кроссинговер между гомологичными хромосомами.

3. Сателлитная ДНК всегда располагается тандемно по 100-200 единиц в блоке. Образуются длинные последовательности в геноме.

4. У недавно образовавшихся на одной территории близких видов сателлитная ДНК заведомо разная.

Это обеспечивает бесплодие возможных межвидовых гибридов.

Умеренные повторы

К умеренным повторам относят как транскрибируемые и транслируемые, так и только транскрибируемые, но нетранслируемые последовательности ДНК и регуляторные участки.

Гены tРНК в среднем повторяются в геноме 5 тыс. раз. Гены sРНК - сотни тысяч раз.

Уникальные гены

У человека, по разным оценкам, 30-50 тыс. генов. Большинство генов - уникальны. Но даже в них есть повторяющиеся элементы. Это - некоторые экзоны.

Все гены разделяют на гены "домашнего хозяйства" и гены "роскоши".

Гены "домашнего хозяйства" кодируют то, что всегда нужно любой клетке независимо от ткани.

По разным оценкам таких генов у человека 10-20 тыс. Это гистоновые гены, гены tРНК, rРНК и т.п. Гены "роскоши", которых заведомо больше в 2-3 раза, это гены, которые экспрессируются в клетках определенных тканей и в определенное время. Например, все гены белковых гормонов - гены "роскоши".

Другая классификация генов

1. Уникальные гены, имеющие специализированную функцию.

Например, глобиновый, инсулиновый и другие гены. Они экспрессируются лишь в определенных клетках.

2. Уникальные гены, обладающие общими функциями, экспрессирующиеся в подавляющем большинстве клеток.

Эти гены плохо изучены.

3. Множественные сгруппированные гены.

Это гены rРНК, часть генов tРНК, часть гистоновых генов.

4. Множественные рассеянные гены.

Это оставшаяся часть гистоновых генов, оставшиеся гены tРНК и большинство генов sРНК, а так же МДГ (мобильные диспергированные (рассеяные) гены).

Лекция 19. Нестабильность генома. Обратная транскрипция

В 40-х годах Барбара Мак-Клинток, американский генетик, обнаружила мозаичность окраски зерен у кукурузы, небъяснимую законами Менделя и мутационной теорией.

Она предположила, что некоторые гены могут менять свое место в геноме.

Определение: мобильные генетические элементы (МГЭ) - это последовательности нуклеотидов, меняющие свою локализацию и копийность в геноме.

Выделяют следущие классы МГЭ:

1. IS - вставочные элементы у прокариот.

2. Tn - транспозоны у прокариот.

3. Эписомы у прокариот.

4. Некоторые умеренные фаги.

5. Контролирующие элементы кукурузы.

6. Мобильные диспергированные гены у дрозофилы, мыши, человека.

7. Провирусы.

В литературе "транспозоны" - все мобильные генетические элементы. Это элементы генома, которые меняют свое положение и копийность в геноме.

IS-элементы

Это самые простые транспозоны.

Размер IS-элементов ~1000 п.н. На концах они содержат инвертированные повторы (~20 п.н.). IS- элементы содержат только один ген - ген транспозазы, фермента, обеспечивающего перемещение IS-элемента по геному.

Транспозаза - это обобщеный термин.

Разные транспозазы работают по-разному, но смысл общий:

транспозаза вырезает ДНК в одном месте и вставляет в другое место генома.

Перед геном в IS-элементе имеется промотор, за геном - слабый терминатор транскрипции. Не всегда РНК-полимераза останавливается на нем, она может продолжать транскрибировать и рядом стоящий участок генома до сильного терминатора.

Tn-транспозоны

Помимо гена транспозазы Tn-транспозоны содержат один или несколько генов лекарственной устойчивости. Копийность транспозона возрастает при наличии провокационного фона (например, наличие в среде антибиотика, ген устойчивости к которому кодируется в транспозоне).

Есть транспозоны, не содержащие гена транспозазы.

Такие транспозоны содержат по краям IS-элементы.Размер транспозонов - 2.5-10 тыс. п. н.

Всем транспозонам свойствен-но наличие прямых повторов, LTR (long terminal repeats - длинные концевые повторы)

После перехода из основной ДНК в плазмиду транспозон может попасть с ней в другую бактерию, придавая новому хозяину ранее отсутствующую лекарственную устойчивость. Кроме того, при вырезании транспозона из геномной бактериальной ДНК захватываются участки генома одной бактерии, которые вместе с транспозоном переносятся в другую бактерию. Захват ДНК происходит, если эта ДНК находится между двумя транспозонами.

Умеренные фаги

-фаг может захватывать часть генетической информации одной бактерии и переносить ее в другую. Поэтому сегодня говорят о едином генофонде прокариот.

Эффекты, вызываемые мобильными элементами

- Внедрение мобильных элементов внутрь гена приводит к выключению гена.

- Может нарушаться регуляция гена, если мобильный элемент внедряется между оператором и цистроном (у мобильного элемента есть свой промотор).

- Вставка мобильного элемента может привести к экспрессии генов, которые не должны в данное время работать.

Наличие мобильных элементов является фактором, способствующим незаконной рекомбинации.

При незаконной рекомбинации перетасовываются гены, не имеющие отношения друг к другу.

Мобильные элементы провоцируют образование делеций, инверсий, дупликаций. Все это - хромосомные мутации.

Некоторые вирусы - на самом деле тоже мобильные элементы. В форме провируса они находятся в геноме клетки хозяина, а потом могут начать перемещаться. Это, например, онкорнавирусы, являющиеся ретровирусами.

Молекулярные основы канцерогенеза

Признаки трансформированной клетки

1. Неконтролируемое деление.

Искажен клеточный цикл. Продолжителен S-период. Стадия G2 сведена к минимуму. Клетка вступает в митоз неготовой.

Последствия: нарушения при расхождении хромосом.

Высокая потребность в энергии. При этом в элокачественных клетках гликолиз (идущий без кислорода) превалирует над окислительным фосфорилированием.

2. Клетки перестают узнавать друг друга.

Происходит утрата контактного торможения. Это связано с изменением мембранных белков - белков-рецепторов и пр.

Нарушается адгезия (прилипание к поверхности).

3. Раковые клетки дедифференцированы.

Теории рака

До 70-х годов существовало три теории рака:

1. Канцерогенная теория.

Известны професиональные раковые заболевания: рак кожи у трубочистов, рак губы у кровельщиков и пр.

Бензпирен - первый описанный канцероген.

Определение: канцерогены - это вещества, повышающие частоту возникновения рака.

Но в экспериментах с канцерогенами не все животные заболевали.

2. Генетическая теория.

Появилась в 30-х годах. У лабораторных мышей известны высоко- и низкораковые лабораторные линии

3. Вирусная теория.

В молоке мышей был найден "фактор молока" (вирус Битнера).

Объединение всех этих теорий произошло в 50-х годах. Отечественный ученый Лев Зильбер высказал гипотезу, что причиной рака может быть вирус, который становится геном.

Обратная транскрипция

Определение: обратная транскрипция - это синтез ДНК по матрице РНК.

Обратную транскрипцию обнаружили в 1970 г. Темин, Балтимор, Дульбеко, работавшие с вирусом саркомы Рауса (ВСР). Этот вирус вызывает саркому у кур. Это онкорнавирус (oncoRNA) - относится к ретровирусам.

Определение: ретровирусы - это РНК-содержащие вирусы, в жизненный цикл которых входит стадия образования ДНК обратной транскриптазой и внедрение ее в геном клетки хозяина в форме провируса.

Предпочтительного места внедрения провируса в геном нет. Это позволяет отнести его к мобильным генетическим элементам.

В состав ретровируса входит две идентичные молекулы РНК. На 5'-конце имеется Сap, на 3'-конце - поли А-хвост. Фермент обратную транскриптазу вирус "носит" c собой.

Геном ретровируса содержит 4 гена: gag - белок нуклеоида,

pol - обратная транскриптаза,

env - белок капсида (оболочки),

onc - онкоген, ответственный за злокачественную трансформацию клетки.

str5 = str3 - (short terminal repeat) короткий концевой повтор;

U5, U3 - уникальные последовательности (U5 - 80 н., U3 - 200 н.);

PB (primer binding site) - участок связывания затравки.

На РВ садится (за счет комплементарности) tРНК и служит затравкой для синтеза ДНК.

Синтезируется небольшой кусок ДНК.

Обратная транскриптаза, обладая еще и активностью РНК-азы Н, удаляет РНК в гибриде с ДНК, а за счет идентичности str3 и str5 этот одноцепочечный участок ДНК взаимодействует с 3'-концом второй молекулы РНК, которая служит матрицей для продолжения синтеза цепи ДНК.

Затем РНК-матрица уничтожается и по образовавшейся цепи ДНК строится комплементарная.

Образованная молекула ДНК длиннее РНК. Она содержит LTR (U3 str 3(5) U5). В форме провируса она находится в геноме клетки хозяина. При митозе и мейозе передается дочерним клеткам и потомкам.

Для экспрессии вирусных генов нужен толчок: канцерогены, изменения метаболизма в клетке хозяина, стресс.

Большинство изученных вирусных онкогенов кодируют протеинкиназу, фермент, который фосфорилирует белки. Как правило - это тирозиновая протеинкиназа. В клетке есть собственные протеинкиназы, в том числе и тирозиновая, но гораздо более активны сериновая и треониновая. Гены, кодирующие клеточные протеинкиназы, обозначают onc_c, вирусные - onc_v. Onc_c - клеточные гены, работающие в дифференцированных клетках. Onc_c имеют интроны, onc_v - не имеют. Onc_v либо добавляет тирозиновую протеинкиназу - и сказывается дозовый эффект гена тирозиновой протеинкиназы, либо, по сравнению с клеткой, не имеющей onc_v, клетка, его имеющая, фосфорилирует тирозин, а не серин или треонин, как обычно, то есть происходит смена мишени.

В первую очередь это касается белков, присутствующих в клетке в большом количестве. Это белки цитоскелета (нарушение адгезии), мембранные белки (нарушение контактного торможения), гистоны (нарушение регуляции, компактизации, облегчение репликации ДНК).

Ретровирусы скорее всего возникли в результате внедрения мобильных элементов в непосредственной близости от onc_c генов. В дальнейшем onc_c превратился в onc_v, а клеточная полимераза - в обратную транскриптазу. Вирус начал самостоятельную жизнь. Стадия провируса говорит о его клеточном происхождении.

В медицине рак - это злокачественная опухоль только эпителиальных тканей.

Метастазы - возникающие опухоли в районе удаления от исходной опухоли.

Рак - болезнь генома.

Одним из путей активации onc_c является такая перестройка генома, в результате которой рядом с онкогеном появляется новый регуляторный элемент, обеспечивающий его более активную транскрипцию.

Другой путь - структурная мутация в протоонкогене, т.е. нормальном клеточном гене, способном превратиться в онкоген.

Существуют антионкогены, или гены-супрессоры опухолей, подавление активности которых приводит к развитию опухолей.

Природа белковых продуктов онкогенов и антионкогенов чрезвычайно разнообразна. К онкогенам относят некоторые гены белков - факторов роста, а также гены рецепторов факторов роста. Перепроизводство факторов роста или нарушение структуры их рецепторов может привести к более частому делению клеток. Изменения в генах, кодирующих белки - передатчики сигналов от рецепторов к ядру клетки, в основном, протеинкиназы различной специфичности, а также изменения экспрессии генов, ответственных за белковые факторы транскрипции, могут превратить нормальную клетку в раковую.

Подавление активности генов, ответственных за рост и размножение клеток, осуществляется белковыми продуктами генов - супрессоров опухолей. Так, ключевая роль в разрешении на переход из одной фазы клеточного цикла в другую принадлежит белкам - циклинам. Только находясь в комплексе с циклинами, циклинзависимые протеинкиназы способны фосфорилировать белки мишени, необходимые для перехода в следующую фазу клеточного цикла.

Специальные белки сканируют ДНК перед репликацией на предмет выявления нерепарированных повреждений. Если ДНК не проходит тест, то включаются системы реализации "запрограммированной смерти" - апоптоза, в результате чего разрушаются жизненно важные структуры клетки, в том числе хромосомы и цитоскелет. Апоптоз определяется большим числом генов, центральное место среди которых занимает ген, кодирующий белок с молекулярным весом 53 кДа, - ген p53. Этот ген поврежден в 50% всех опухолей человека. Когда он выведен из строя, клетки с поврежденной (мутантной) ДНК перестают выбраковываться и в них происходит накопление новых мутаций, которые могут затрагивать как протоонкогены, так и гены-супрессоры опухолей.

Как правило, рак развивается у людей пожилого и старого возраста. Это связано с тем, что мутации возникают случайно - и вероятность накопления в клетке нужного для злокачественного превращения набора измененных генов увеличивается с годами. Посчитано, что в среднем в клетке человека должно накопиться 10 независимых мутаций, касающихся онкогенов и генов - супрессоров опухолей.

Лекция 20. Молекулярно-биологические

основы возникновения жизни на Земле

Гипотезы возникновения жизни

Панспермия - жизнь витает в космосе и разносится по планетам.
Жизнь зародилась абиогенно или нет?

Биогенез - живое только от живого.

Абиогенез - живое от неживого.

Луи Пастеру принадлежит первое прямое доказательство происхождения живого только от живого. В 1862 году он получил премию Французской академии наук за эту работу.

Суть опыта: в колбе с изогнутой трубкой находился прокипяченный сенный настой. В течение нескольких недель он стоял совершенно прозрачный. Как только колбу наклонили (сквозь трубку в колбу попали микроорганизмы) - настой забродил.

Эксперимент правильный. Вывод - живое только от живого.

Авторитет Пастера был столь велик, что к теории абиогенеза пришли лишь через 60 лет.

В 1924 году Александр Опарин высказал предположение, что ~4 млд. лет назад жизнь могла возникнуть абиогенно, в силу тех условий, которые существовали тогда на Земле.

Джон Холдейн рассчитал, какие условия и как долго должны были существовать, чтобы зародилась жизнь, каковы необходимые источники энергии для зарождения жизни.

Теория биопоэза

Джон Бернал создал теорию биопоэза, включающую три стадии.

1. Образование биомономеров.

2. Образование биополимеров и их эволюция. Образование систем с обратной связью.

3. Образование мембранных структур и пробионтов (первых клеток).

Экспериментальное доказательство первой стадии - опыты Стенли Миллера.

Суть опыта: в колбе находилась смесь газов (H₂, N₂, NH₃, CH₄, CO, CO₂) при температуре ~ 100 ⁰C. Кипящая вода служила источником водяного пара, а с помощью обратного холодильника поддерживалась циркуляция газовой смеси через сосуд. Давали искровой разряд в 60 тыс. вольт, что энергетически эквивалентно 50-и млн. лет на примитивной Земле. Результат был ошеломляющий: в колбе появились HCN, HCHO, HCOOH, несколько аминокислот, несколько азотистых оснований жирные кислоты, псирты, моносахара. Эксперимент повторяли много раз. Неперменное условие успеха - отсутствие в колбе свободного кислорода. В зависимости от pH раствора и соотношения газов были получены разные наборы соединений. Если была H₃PO₄, то образовывались даже нуклеотиды, а это уже гетерополимеры.

Таким образом была доказана первая стадия возникновения жизни. 4 млрд. лет тому назад с неизбежностью должны были возникнуть биомономеры.

Первичная атмосфера образующейся Земли кислород содержала, но он весь пошел на окисление. Свободного кислорода не было. Таким образом, возникновение биомономеров и биополимеров происходило во вторичной бескилородной среде.

У стадии 3 в принципе есть доказательства. Самая сложная и неочевидная - стадия 2.