Общая характеристика патогенности и вирулентности бактерий

Как уже упоминалось выше, главным отличием болезнетворных микроорганизмов от свободноживущих является их способность к симбиотическому существованию. В настоящее время ни у кого не вызывает сомнений, что для такого существования необходимы многочисленные гены, приобрести которые возможно только в ходе длительного эволюционного развития. В свою очередь, сравнивая паразитирующие и живущие в мутуалистическом или комменсальном симбиозе виды бактерий, можно отметить, что первые достигли более высокого уровня специализации, поскольку обладают специфическими приспособлениями для непосредственного использования внутренней среды сожителя.

В то же время для макроорганизмов, в особенности высших животных, главным условием существования является поддержание постоянства внутренней среды, они, как результат собственной длительной эволюции, получили сложные и эффективные механизмы защиты от всего, что может нарушить их гомеостаз. Учитывая это, можно уверенно говорить, что те виды микроорганизмов, которые получили способность успешно паразитировать во внутренней среде млекопитающих, являются наиболее эволюционно продвинутыми, и ясно что, эта способность является результатом взаимодействия продуктов многих генов. Именно эту способность, а точнее совокупность признаков, обуславливающих потенциальную способность бактерий проникать во внутреннюю среду макроорганизма и использовать ее как среду обитания, называют патогенностью. Здесь следует подчеркнуть, что понятие патогенность всегда соотносится с конкретным видом-хозяином или группой видов-хозяев, поскольку это всегда симбиотические отношения. Другими словами говоря, не бывает просто патогенных видов, а бывают патогены человека, патогены лошади и т.п.

Таким образом, исходя из вышеизложенного, патогенность всегда следует рассматривать как видовую, а не индивидуальную (для микроорганизмов - штаммовую) характеристику. В каждом конкретном случае при взаимодействии определенной популяции патогена с организмом-хозяином патогенность, являющаяся свойством генотипическим, проявляется как свойство фенотипическое, которое принято называть вирулентностью. Именно по вирулентности штаммы одного и того же вида патогенных бактерий могут существенно отличаться друг от друга, то есть вирулентность – это степень патогенности.

Таким образом получается, что патогенность - это понятие качественное (иными словами говоря, она либо есть, либо ее нет), а вирулентность – количественное. Поэтому о видах принято говорить патогенный или непатогенный, а о штаммах патогенного вида – высоко вирулентный, слабо вирулентный или даже авирулентный (то есть невирулентный). При этом, несмотря на то, что авирулентный штамм, так же как и непатогенный для определенного хозяина вид, не вызовет инфекционный процесс при заражении, ставить знак равенства между ними нельзя. Непатогенные бактерии не имеют той совокупности генов, которая бы позволяла им колонизировать данного хозяина, а авирулентные – имеют, но по тем или иным причинам не могут полностью выразить эту генетическую информацию.

Следует сделать оговорку и о таком термине, как условно-патогенные микроорганизмы. В зависимости от контекста эти же микроорганизмы могут называть также оппортунистическими или потенциально-патогенными. Во всех случаях речь идет о микроорганизмах, для которых основным способом существования является симбиоз с макроорганизмом, протекающий по пути мутуализма или комменсализма. Такой тип симбиоза обусловлен наличием у макроорганизма хорошо выраженных защитных барьеров на пути проникновения в их внутреннюю среду, которые данные микроорганизмы в норме преодолеть не могут. В качестве яркого примера здесь можно рассматривать сложные микробоценозы, формирующиеся в толстом кишечнике высших животных и человека. В составе таких микробных ценозов практически всегда присутствуют виды, способные вызвать заболевания, однако слизистая оболочка кишечника не является для них входными воротами. Среди них, например, способные вызывать тяжелые посттравматические заболевания представители рода Clostridium, представители родов Proteus, Enterobacter, Pseudomonas и Klebsiella, при определенных условиях поражающие различные системы органов. На кожных покровах и слизистых оболочках дыхательного тракта постоянно присутствуют бактерии из родов Staphylococcus, Streptococcus, Peptostreptococcus, Haemophilus, с которыми медики связывают определенные заболевания кожи и органов дыхания.

В отличие от облигатно-патогенных микроорганизмов такие бактерии не обладают факторами активного внедрения во внутреннюю среду здорового человека и способны длительно вести сапротрофный образ жизни, то есть контакт с партнером по симбиозу не является абсолютным критерием для их существования. Тем не менее, в геноме таких бактерий, в отличие от типичных сапротрофов, имеется совокупность генов, определяющих их способность существовать во внутренней среде высших животных и противостоять их внутренним защитным факторам, например фагоцитозу или действию системы комплемента. Поэтому при снижении эффективности защитных свойств покровов или нарушении их целостности макроорганизм может быть инфицирован и тогда может иметь место инфекционный процесс.

Причинами снижения иммунного статуса людей, приводящего к инфицированию условно-патогенными микроорганизмами, может быть действие физических, химических и биологических факторов. Среди физических факторов можно выделить повышенные дозы излучений, длительное воздействие неблагоприятных температур, ожоговые или механические травмы. Снижает резистентность организма человека к условно-патогенным микроорганизмам и действие различных химических факторов. Особенно неблагоприятным в этом отношении может быть избыточное и длительное воздействия алкоголя, наркотических средств, малых доз различных токсических веществ, попадающих в окружающую человека среду при производственной и сельскохозяйственной деятельности. Биологическими факторами снижения резистентности могут быть врожденные или приобретаемые в течение жизни иммунодефициты, а также инфекционные заболевания, вызванные облигатными патогенами.

Наглядной демонстрацией справедливости последнего утверждения служит широкая распространенность внутрибольничных инфекционных заболеваний, большая часть которых вызывается как раз условно-патогенными видами. Вспышки госпитальных инфекций кокковой, псевдомонадной, протейной или клебсиельной этиологии регистрируются гораздо чаще, чем подобные же заболевания среди здоровых людей. Следует отметить, что постановка диагноза и выяснение причин резкого ухудшения состояния пациентов в случаях таких внутрибольничных инфекций представляет собой немалые трудности. Дело в том, что условно-патогенные возбудители, как правило, не обладают выраженной органотропностью и способны вызывать поражения очень разных систем органов. Кроме того, симптомы вызываемых ими заболеваний обычно сильно вариабельны и в большинстве случаев накладываются на симптомы уже протекающего первичного инфекционного процесса. Довольно часто иммунный ответ на внедрение условно-патогенных организмов выражен в меньшей степени, чем на присутствие облигатных патогенов, что способствует острохроническому или хроническому протеканию или же переходу инфекционного процесса из локальной в генерализованную форму. Поэтому без специального обширного микробиологического исследования правильная постановка диагноза и выбор эффективной терапии вызываемых условно-патогенными микробами заболеваний (так называемых оппортунистических инфекций) крайне затруднительны.

Возвращаясь к общим свойствам патогенных бактерий, можно сказать, что сравнение различных видов и штаммов внутри вида как облигатно-патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов проводят, определяя степень их вирулентности. Как правило, при характеристике каждого штамма стараются определить выраженность конкретных факторов патогенности, используя для этого специально разработанные методы исследования in vitro. Однако вирулентность, как совокупное действие характерного для каждого возбудителя комплекса факторов патогенности, возможно определить только in vivo.

Для этого проводят экспериментальное заражение либо восприимчивых к данному возбудителю организмов, либо специально подобранных модельных живых систем. В ветеринарных или фитопатологических исследованиях, как правило, оказывается возможным использовать в таких экспериментах особи непосредственного хозяина для изучаемого паразита. При изучении большинства возбудителей болезней человека для определения вирулентности приходится эмпирически подбирать модельные объекты из числа так называемых лабораторных животных, среди которых основными являются представители отряда грызуны (белые мыши, белые крысы, морские свинки) или отряда зайцеобразные (кролики). В тех случаях, когда стандартные лабораторные животные не являются чувствительными к изучаемому патогену, используются другие виды, исходя из наличия возможностей содержания их в условиях, необходимых для проведения эксперимента.

В тех случаях, когда это возможно, животных заменяют на так называемые живые системы, в качестве которых используют куриные эмбрионы или культуры клеток животных или человека. Делается это преимущественно из-за гуманного отношения к животным, которое в настоящее время признано доминирующим и в научных кругах. Как известно, в мире существует мощное общественное движение в защиту животных, включающее в себя представителей различных слоев общества. К сожалению, многие из участников этого движения необоснованно считают, что все проводимые на животных эксперименты должны быть прекращены немедленно и обвиняют ученых в негуманном к ним отношении. Такой подход к данной проблеме базируется на непонимании того, что все проводимые на животных научные эксперименты, во-первых, осуществляются только тогда, когда нет других возможностей получить необходимые для развития науки и медицины сведения, и, во-вторых, осуществляются они так, чтобы причинять подопытным животным как можно меньше вреда. Поэтому задачей каждого грамотного человека является при необходимости объяснять эти принятые и выполняемые современными учеными положения тем сторонникам защиты животных, которые пока еще не компетентны в достаточной степени в этом вопросе.

Поскольку инфекционный процесс представляет собой динамическое взаимодействие множества факторов как хозяина, так и паразита, при инфицировании каждой конкретной особи наблюдаются различия в его протекании. Кроме того, оценка проявления тех или иных симптомов оказывается практически всегда субъективной. В силу этого все методики определения вирулентности базируются на двух основных правилах: 1) количество взятых в опыт чувствительных к патогену живых систем должно обеспечивать статистическую достоверность результатов; 2) оценивать результат воздействия патогена необходимо по утрате жизнеспособности (гибели) инфицированной живой системы. Исходя из второго правила единицами вирулентности являются так называемые летальные дозы.

В медицинской микробиологии традиционно используются три основные единицы. Одна из них называетсяDCL, что является аббревиатурой от латинской фразы Dosis certa letalis, переводимой как «абсолютно смертельная доза». В русскоязычной литературе возможно написание этой аббревиатуры с использованием букв русского алфавита - ДСЛ. Кроме того, синонимами для ДСЛ являются ДСЛ100 или DCL100. Уже из названия видно, что ДСЛ представляет собой такую дозу испытуемого агента, при введении которой наблюдается гибель всех использованных в эксперименте живых систем.

Следующая единица - это ДЛМ (DLM, Dosis letalis minima) или минимальная смертельная доза. Под этим термином понимают то количество микроорганизмов, которое вызывает в условиях эксперимента летальный исход у более чем 90%, но не у 100% инфицируемых живых систем. Как правило, при использовании этой единицы указывают конкретный процент гибели, например ДЛМ95.

Наиболее часто используемой и наиболее показательной в плане сравнения вирулентности штаммов является единица ДЛ50 (синонимы – ЛД50, DL50). Это то количество микроорганизмов, при котором наблюдается смерть 50% взятых в опыт живых систем. Для достоверного определения этого показателя в большинстве случаев используют метод (способ) Кербера или его модификации. Этот метод позволяет использовать наименьшее из дающих достоверные результаты количество животных или других живых систем. Рассчитанные по этому способу значения ЛД50 представляют собой десятичный логарифм того количества испытуемого агента, которое вызывает 50-процентный летальный исход.

Метод Кербера может быть использован не только для определения вирулентности микроорганизмов, но и для определения продукции ими конкретных токсических веществ (токсигенности), а также для оценки собственно токсичности того или иного вещества.

Определение DL50 (Dosis letalis 50) по способу Кербера включает следующие обязательные пункты:

1.Подопытные животные должны быть стандартизированы по виду, породе, линии, массе, возрасту, в некоторых случаях полу.

2.Необходимо 4 - 6 групп по 6 - 10 особей в группе.

3.Анализируется не менее четырех доз (разведений) испытуемого агента.

4.Каждую дозу вводят всем животным одной группы, количество животных в группах должно быть одинаковым.

5.При числе подопытных животных 10 и менее на дозу величина отношений каждой последующей дозы к предыдущей (шаг разведения) должна быть постоянной и равняться при испытании на:

вирулентность - 10 (d = 1), токсичность - 3 (d = 0,477), токсигенность - 1,5 или 2 (d = 0,176 и 0,3, соответственно).

6.Расчет осуществляют по формуле lgDL50=lgDN - d (åLi - 0,5),

где DN - наибольшая из испытанных доз, d (дельта) - логарифм отношения каждой последующей дозы к предыдущей; Li - отношение числа погибших от данной дозы животных к общему количеству животных, получившим эту дозу; åLi - сумма всех значений Li для всех испытанных доз.

Несмотря на то, что приведенный здесь стандартный метод был предложен в свое время для проведения экспериментов на животных (см. пункт 1), он применим в таком варианте и при использовании других живых систем.

Необходимость проведения экспериментов по определению вирулентности конкретных штаммов обусловлена двумя основными причинами. Во-первых, для понимания действия конкретных факторов патогенности и регулирования экспрессии кодирующих эти факторы генов необходимо получение мутантных по этим генам вариантов изучаемых возбудителей и затем оценка изменений в их вирулентности по сравнению с исходным штаммом. Во-вторых, при выделении из клинического материала новых, еще не встречавшихся ранее в медицинской практике штаммов желательно в наиболее короткие сроки получать сведения об их вирулентности. Это делается для того, чтобы при последующем обнаружении этих возбудителей в ходе конкретных случаев заболевания правильно назначать и осуществлять меры лечения и профилактики. Следует подчеркнуть, что первая из вышеописанных причин также имеет под собой не только чисто научный интерес: ведь только на основе фундаментальных знаний о реализации патогенных свойств на клеточном и молекулярном уровнях можно разрабатывать максимально эффективные средства борьбы с инфекционными заболеваниями.

Как уже указывалось выше, вирулентность является фенотипическим проявлением патогенности. Поскольку суть любого фенотипа – это результат взаимодействия генотипа и условий окружающей среды, проявление вирулентности также зависит от этих условий. Еще в 19-ом веке было замечено, что длительное выращивание патогенных бактерий на питательных средах, то есть вне контакта с организмом-хозяином, может приводить к существенному снижению их вирулентных свойств вплоть до потери способности вызывать заболевание. К подобному результату может приводить и многократное пассирование возбудителя в мало восприимчивом хозяине. Такое ослабление вирулентности, как правило, не приводит к безвозвратной утрате болезнетворных свойств. При восстановлении благоприятных для проявления факторов патогенности условий микроорганизм проявляет присущий данному штамму уровень вирулентности. В этих случаях изменение вирулентности называется фенотипическим.

В то же время возможно выделение естественно циркулирующих (клинических) наследственно слабовирулентных или даже авирулентных штаммов патогенного вида бактерий или получение таких же вариантов путем направленного воздействия на исходно высоковирулентный штамм в лабораторных условиях. В этих случаях говорят о генотипическом снижении уровня вирулентности.

Обнаруженные поначалу чисто случайно факты снижения вирулентности послужили основой для направленного получения ослабленных по вирулентности вариантов с целью использования их в качестве вакцинных препаратов. Фактически именно таким образом были получены аттенюированные (ослабленные) живые вакцины, первой из которых была сделанная Луи Пастером вакцина против куриной холеры. Естественно, что для получения вакцинных штаммов наиболее пригодны варианты с генотипическим снижением вирулентности, поскольку они более безопасны в плане возникновения болезненного состояния у прививаемых.

Следует также отметить, что кроме ослабления вирулентности возможно и ее усиление, также условно разделяемое на фенотипическое и генотипическое. В последнем случае причиной повышения вирулентности могут служить мутации в генах, кодирующих либо собственно факторы патогенности, либо определяющих регуляцию экспрессии вышеназванных генов. Однако поскольку частота любых мутаций изначально не велика, более существенной причиной генотипического повышения вирулентных свойств является перенос генетической информации от одних патогенных бактерий к другим в ходе естественных процессов обмена – трансформации, трансдукции и конъюгации.