Скрининговые исследования
Диагностика ВИЧ-инфекции
Лабораторная диагностика при ВИЧ-инфекции направлена на решение следующих основных задач:
- проведение скрининговых исследований с последующим подтверждением результатов для определения ВИЧ – статуса пациента (инфицирован/не инфицирован ВИЧ);
- иммунологический и вирусологический мониторинг ВИЧ-инфицированных, состоящих на диспансерном учете и получающих антиретровирусную терапию;
- определение резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам;
- установление ВИЧ – статуса детей, рожденных ВИЧ - инфицированными матерями;
- серологическая и молекулярно - биологическая диагностика гепатитов;
- серологическая и молекулярно – биологическая диагностика оппортунистических заболеваний;
- контроль качества лабораторных исследований.
Для диагностики ВИЧ-инфекции используют методы, направленные на: а) выявление специфических антител к ВИЧ; б) обнаружение вирусных антигенов; в) определение наличия вируса методом культивирования in vitro.
Иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее распространенным методом для проведения скрининговых исследований по диагностике ВИЧ – инфекции в России. Общим признаком методов иммуноферментного анализа является использование иммунных агентов – антител и антигенов. В основе ИФА лежит связывание иммобилизованных на микропланшетах вирусных антигенов с антителами, содержащимися в сыворотках больных, с последующим выявлением комплекса антиген – антитело с помощью проявляющей системы, в качестве которой используются антивидовые антитела, конъюгированные с ферментной меткой.
Существует несколько поколений тестов ИФА. В настоящее время эффективность диагностики ВИЧ повысилась за счет использования ИФА тест – систем 4-го поколения, позволяющих выявлять не только антитела, но и антиген ВИЧ (так называемые ВИЧ Аг/Ат комбинированные тесты). В подобных тест – системах в качестве иммуносорбента помимо антигенов ВИЧ используются антитела к белку ВИЧ - 1 р24. Применение тест – систем 4-го поколения позволило сократить период «серологического окна» до 3-х недель.
В РФ зарегистрированы две тест-системы 4 генерации зарубежного производства, которые наиболее эффективны при обследовании доноров крови и органов - наиболее опасных групп для распространения ВИЧ-инфекции -"Вироностика ВИЧ Униформ II Аг/Ат" фирмы "Органон-техника" (Голландия) и "Джен скрин плюс ВИЧ Аг/Ат" фирмы "Биорад" (Франция).
Качество иммуноферментных тест – систем оценивается по ряду показателей, главными из которых являются чувствительность и специфичность. Чувствительность отражает вероятность, с которой при помощи тест – системы можно определить наличие исследуемого вещества в опытном образце. Специфичность – характеристика избирательности тест – системы, показывающая насколько вероятно, что реакция будет протекать именно с искомым веществом, а не с другими компонентами исследуемого образца. Именно благодаря своей высокой чувствительности (более 99,5%) ИФА вошел в ряд наиболее популярных методов лабораторной диагностики различных заболеваний человека.
В ИФА проводится качественная оценка результатов, которая предполагает выдачу двух вариантов ответа: результат положительный или отрицательный.
При обследовании пациента на ВИЧ – инфекцию методом ИФА возможно получение ложноотрицательных результатов. Это может иметь место в период «серологического окна», когда инфицирование произошло относительно недавно, уровень антител в крови пациента еще очень низкий и чувствительность тест – систем недостаточна для их выявления. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться и в терминальной стадии болезни, характеризующейся тяжелым поражением иммунной системы с глубоким нарушением процесса образования антител. Также причинами ложноотрицательных результатов могут быть наличие в сыворотке антител к аутоантителам HLA класса II и другим аутоантигенам, болезни печени, недавняя вакцинация и т.д. Это связано с недостаточной степенью специфичности тест систем в сочетании с высокой чувствительностью.
При получении положительного результата в ИФА все образцы должны быть дополнительно исследованы в подтверждающем тесте.
Быстрые тесты
Быстрые тесты (или экспресс – тесты) позволяют выявлять антитела к ВИЧ без использования специальной лабораторной техники и в короткие сроки (10-30 минут).
Возможность получения точных, воспроизводимых результатов в короткое время позволяет использовать быстрые тесты в целом ряде ситуаций: рутинная диагностика в небольших диагностических лабораториях, тестирование во время ургентных ситуаций (экстренные хирургические вмешательства); тестирование пациентов, с которым и имел дело медицинский персонал, получивший травму во время инвазивных процедур, тестирование беременных женщин в предродовом периоде, не имеющих полноценного обследования на ВИЧ – инфекцию при поступлении в родильный дом. Кроме того, целесообразно использование быстрых тестов при обследовании «труднодостижимых» групп населения (например, внутривенных наркоманов или «коммерческих секс – работников»), а также при проведении исследований в отдельных районах.
Самыми простыми являются иммунохроматографические тесты, представляющие собой тест – полоски с иммобилизованными рекомбинантными антигенами и синтетическими пептидами ВИЧ – 1, 2. Плазма или сыворотка крови наносится на специальную пористую часть полоски. Результат выявляется в виде окрашенной полосы.
С помощью простых быстрых тестов результат может быть получен в течение 10-30 минут.
В настоящее время выпускаются быстрые тесты, позволяющие выявлять только антитела к ВИЧ, поэтому в период «серологического окна» тесты могут давать отрицательный результат.
При получении положительного результата в быстром тесте исследуемый образец должен быть дополнительно исследован в подтверждающем тесте.
К настоящему времени ВОЗ рекомендовано три стратегии тестирования антител к ВИЧ, которые направлены к максимальной информативности тестирования при минимально возможной стоимости анализа.
Во всех случаях обследования крови в организациях переливания крови или трансплантации органов следует применять стратегию № 1.
При мониторинге населения на наличие ВИЧ-инфекции при показателе > 10% - стратегия № 1, при показателе < 10% - стратегия №2.
При постановке диагноза ВИЧ в случае клинических признаков ВИЧ/ симптомов ВИЧ при показателе >30% - стратегия № 1, при показателе ≤ 30% -стратегия № 2. При отсутствии симптомов ВИЧ при показателе > 10% — стратегия № 2, при показателе ≤ 10% - стратегия №3.
Стратегия № 1
Все образцы сывороток плазмы тестируются в ИФА или в простом/быстром тесте. Реактивные сыворотки обозначаются как положительные, содержащие антитела к ВИЧ, нереактивные - как отрицательные, не содержащие антитела к ВИЧ. Позитивные на ВИЧ сыворотки верифицируются в иммуноблоте. При обследовании доноров крови или органов предпочтение следует отдавать комбинированным ВИЧ -1/ВИЧ 2 тестам с выявлением ВИЧ - антител и ВИЧ – антигена с наиболее высокой чувствительностью. В таком случае доноры, образцы сывороток которых оказались реактивными при первичном обследовании в наиболее чувствительном ИФА - тесте, должны быть отклонены от донорства.
При мониторинге населения на ВИЧ чувствительность ИФА тестов должна быть не менее 95%.
Стратегия №2.
Все образцы сыворотки/плазмы крови первично тестируются в ИФА-тесте или в простом/быстром тесте. Первично реактивные (позитивные) образцы тестируются повторно в ИФА-тесте или быстром/простом тесте, основанных на других антигенах или в тестах, полученных по принципиально другой технологии. Повторно реактивные образцы обозначаются как положительные, содержащие антитела к ВИЧ. Нереактивные образцы признаются отрицательными. Образцы сывороток, реактивные в первичном тесте, но нереактивные при повторном тестировании - должны быть ретестированы в двух различных ИФА-тестах. Если получены противоречивые (конкордантные) результаты в двух ИФА тестах, сыворотка признается как неопределенная. Все неопределенные результаты должны быть зафиксированы и должны анализироваться отдельно в отчетах, а пациенты, от которых получены такие образцы, должны быть взяты под наблюдение для последующего обследования.
Стратегия № 3
Так же, как при стратегии № 2, все сыворотки первично тестируются в ИФА-тест-системе или в простом/быстром тесте, реактивные (позитивные) образцы тестируются повторно в другой тест-системе. Первично нереактивные сыворотки обозначаются как ВИЧ - отрицательные. Сыворотки реактивные при первичном тестировании, но нереактивные при повторном исследовании, должны быть исследованы еще раз в обеих тест-системах. Стратегия № 3 требует третьего исследования, если сыворотка выявлена реактивной при первичном и повторном исследовании в одной и той же тест-системе. Третий тест при этом в обязательном порядке должен основываться на тест-системе с другими антигенами или на тест - системе, полученной принципиально другой технологией. Сыворотка, реактивная в 3 тесте, обозначается как ВИЧ-позитивная.
Сыворотка, реактивная при первичной и вторичной постановке, но не реактивная при третьем исследовании, обозначается как неопределенная.
Сыворотка, реактивная при первичном исследовании, но не реактивная во втором и третьем исследовании, также обозначается как неопределенная для пациентов, которые имели контакт по ВИЧ в последние 3 месяца и как отрицательная для пациентов, которые не имели какого бы то ни было риска заражения ВИЧ.
У всех пациентов, которые имели серопозитивные результаты при исследовании первого образца сыворотки крови, следует получить дополнительный образец сыворотки крови для повторного тестирования, чтобы избежать технических или случайных ошибок.
Неопределенные результаты исследования сыворотки крови могут быть получены у ВИЧ-пациентов, имеющих III или IV стадию СПИДа (по критериям ВОЗ).
У пациентов, не имеющих симптомов ВИЧ-инфекции, при неопределенных результатах исследования сыворотки крови необходимо исследовать второй образец сыворотки крови, полученный не ранее, чем через 2 недели после первого образца крови. В случае получения неопределенного результата при обследовании второго образца крови, необходимо провести исследование его в подтверждающем тесте. При этом если неопределенный результат подтверждается через 3, 6, 12 месяцев, пациента следует признать ВИЧ – отрицательным.
Таким образом, стратегия № 1 применяется только для подтверждения клинического диагноза ВИЧ-пациентов на III или IV стадии СПИДа и когда ВИЧ-инфекция регистрируется более чем у 30% населения региона. При более низких показателях распространения ВИЧ для постановки серологического диагноза у пациентов Ш-IV стадий СПИДа используют стратегию №2.
При выборе тестов для выявления ВИЧ-антител для использования в стратегиях № 2 и № 3 для первичного тестирования следует использовать тест-систему с наиболее высокой чувствительностью, тогда как при втором и третьем исследовании тест-системы должны быть с более высокой специфичностью, чем при первичном исследовании образца сыворотки крови.