З фенотипу до гену From phenotype to gene
З фенотипу до гену From phenotype to gene
Після цікавої мутант виявлений і охарактеризовано, ми хочемо знайти ген, в якому сталася мутант
позиційного клонування
Спочатку за допомогою генетичного картування
Потім за допомогою хромосоми ходьбі
Успішний результат генетичної екрані в ідентифікації цікавих мутантів. Після того як ці мутанти були охарактеризовані, наступний крок, як правило, для ідентифікації генів, в яких мутація відбулася. Якщо мутація був проведений хімічний мутаген або іонізуючим випромінюванням, генної ідентифікації зазвичай вимагає генетичного картування та хромосомні ходьбі. Ці методи докладно описані в главі під назвою "Основи розшифровки і встановлення послідовності".
Після цікавої мутант виявлений і охарактеризовано, ми хочемо знайти ген, в якому сталася мутант
позиційного клонування
Спочатку за допомогою генетичного картування
Потім за допомогою хромосоми ходьбі
Успішний результат генетичної екрані в ідентифікації цікавих мутантів. Після того як ці мутанти були охарактеризовані, наступний крок, як правило, для ідентифікації генів, в яких мутація відбулася. Якщо мутація був проведений хімічний мутаген або іонізуючим випромінюванням, генної ідентифікації зазвичай вимагає генетичного картування та хромосомні ходьбі. Ці методи докладно описані в главі під назвою "Основи розшифровки і встановлення послідовності".
20. Candidate-gene approach Кандидат-ген підхід
Якщо мутований ген локалізований в послідовності область хромосоми, а потім подивитися на гени, які можуть бути залучені в процес у рамках дослідження
Останній крок: підтвердження генної ідентифікації
Порятунок фенотип
Мутації в той же ген в різних алелей
Після того, як мутований ген локалізується на порівняно невеликій площі хромосоми, можна шукати те, що відомо як «генів-кандидатів». Кандидат гени генами, які були локалізовані в конкретному регіоні (як правило, через геномної послідовності), які мають гомологію генів, залучених в досліджуваний процес. Цей підхід часто використовується для ідентифікації людських генів захворювань. На слайді показано розташування мутацій тау у хом'яків, який впливає на циркадний ритм. Вона була намічена використанням сінтеніі з мишачих і людських хромосомах, а потім ген був виявлений серед безлічі можливих генів-кандидатів. Після того, як ген-кандидат визначений, воно повинно бути підтверджено, що це дійсно ген, відповідальний за мутантного фенотипу. Найбільш прямий шлях для досягнення цього завдання є введення дикого типу копії гена в організмі мутанта. Якщо фенотип врятована, тобто, він повертається до дикого типу, то ця подія, як правило, вважати достатнім доказом того, що правильний ген був знайдений. Крім того, якщо є кілька алелей з тим же мутантного фенотипу, а потім знайти різні мутації в гені ж у всіх алелей є ще одним способом підтвердження особи ген.
21. інсерційного мутагенезу
Альтернатива хромосоми ходьбі
Щоб скоротити час і зусилля, необхідні для ідентифікації мутантних генів
Вставте фрагмент ДНК, який руйнує гени
Вставки випадково в хромосомах
Зробити сукупність індивідів
Кожен зі вставкою в інше місце
Екран колекцію для фенотипів
Використання вбудованої ДНК для ідентифікації мутований ген
Хромосома ходьба є досить стомлюючим і трудомістким процесом. Щоб скоротити час і зусилля, що спричинило з виявлення мутованих генів, альтернативного підходу була розроблена. Цей метод передбачає використання відомий фрагмент ДНК, щоб викликати мутації, порушуючи генів. ДНК зазвичай вставляє випадково в хромосому. Колекції або бібліотеці фізичних осіб формується, кожна з яких вставляється ДНК в інше місце в хромосомі. Ця колекція може бути обстежені на фенотип інтерес. Після того, як мутант буде знайдений, вбудованої ДНК можна використовувати для швидкого виявлення генів, в який він вставлений.
22. інсерційного мутагенів
Мобільні елементи
Мобільні елементи стрибати з введеною ДНК
наприклад, P елементів у дрозофіли
Або почати з невеликого числа елементів неавтономних
Мобілізація шляхом введення активного елемента
наприклад, AC / DS елементів у рослинах
Single-вставки елементів
наприклад, Т-ДНК в рослинах
Після вставки, не може рухатися знову
Існують різні типи ДНК, які були використані в якості інсерційного мутагенів. Мобільні елементи є мобільні фрагменти ДНК. Один підхід полягає в тому, щоб ввести транспоніруемих елемент плазміди і дозволити їй стрибати в геномі. Це шлях транспоніруемих елемент P була використана для mutagenize геномі дрозофіли. Альтернативний підхід полягає, щоб почати з невеликої кількості мобільних елементів розподілених по всьому геному. Є деякі елементи, які втратили здатність стрибати на своїх власних. Ці елементи відомі як "неавтономних елементів.« Вони залишатися в стані спокою до активного елемента вводиться в геном, в цей час вони починають стрибати. У рослинах, AC / DS система була використана для інсерційного мутагенезу. DS елементи неавтономних і не може стрибати, якщо елемент змінного струму присутній. Одним з потенційних недоліків мобільних елементів є те, що вони можуть вистрибнути з генів. Альтернативний підхід до інсерційного мутагенезу використовує ДНК, що, коли вставлений, не буде рухатися знову. Прикладом таких одним вставки елементів Т-ДНК використовується для заводу мутагенезу. Т-ДНК знаходиться в грунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens, що, природно, в змозі передавати цю ДНК в рослину. Т-ДНК можуть бути розроблені, щоб утримувати цікавить гена.
23. Інсерційного мутагенезу в Arabidopsis
Т-ДНК вставляється в хромосому рослини
Екран для мутацій, які впливають на утворення квітки
Зробити геномну бібліотеку з мутантних ДНК
Зонд з Т-ДНК
Визначити мутант покоління
У моделі заводу, Arabidopsis, інсерційного мутагенезу були використані для виявлення багатьох генів. Наприклад, колекція рослин Arabidopsis приховування Т-ДНК в різних місцях на хромосомі був створений і показаний для мутантів квіти. Мутації в гені кріптогамний результат в трансформації внутрішньої дві квіткові органам. Геномної бібліотеки була зроблена з ДНК з кріптогамний мутант виявлений в колекції рослин проведенні Т-ДНК вставок. Геномної бібліотеки зондували частина Т-ДНК. Гібридизації клони потім послідовно для встановлення особи гена, в якому Т-ДНК була вставлена. Порівняння послідовностей з генами знайдений в базі даних показав, що безстатевий ген кодує новий член MADS-вікно сімейства транскрипційних факторів.
24. активація тегів
Варіації на інсерційного мутагенезу
Робить надлишкової функцією мутації, а не втратою функції мутації
Потенційні визначити функції гена не виявляється через втратою функції екранах
Корисно для таких випадків:
Функціонально надлишкових генів
Гени, необхідні для життєздатності
Активація мічення є варіацією на інсерційного мутагенезу. Замість того, щоб нокаутувати функції генів, активація результати мічення в надлишкової функцією мутацій. Вставка зазвичай несе сильного конститутивного промотору або підсилювач. Надлишкової функцією мутації в результаті введення активації тегів є потенціал, щоб ідентифікувати гени, які будуть пропущені у зв'язку з втратою функції екранами, зокрема, гени, які є функціонально надлишкових (тобто іншого гена в геномі здатний замінити його функції) і гени, які необхідні для життєздатності.
25. Активація позначки в Arabidopsis
Сильні установчих вірусного промотора
CaMV 35S
додана випадково
З Т-ДНК
Коли вставки поруч з геном, відбуваються наступні результати:
активація
установчий вирази
Може призвести до некоректного фенотип
У Arabidopsis, активація помітки були здійснюватися з використанням сильних вірусних підсилювач від Вірус мозаїки цвітної капусти (CaMV) 35S. Цей підсилювач був поміщений в Т-ДНК вектора для трансформації рослин і дозволило випадковим вставити в геном. Коли підсилювач приземлився біля заводу промоутер, це викликало конститувною активації сусідніх генів. Тому що багато гени експресуються тільки в певних клітинах чи тканинах, активація у всіх тканинах може призвести до ненормальним фенотипів.
26. Активація позначки в Arabidopsis II
Приклади мутантного фенотипу знайти в активації позначки екран
В активації-теги експерименту, проведеного лабораторією Детлеф Вайгель за адресою Інституту Солка, багато різних ненормальних фенотипів спостерігалися Arabidopsis. Серед генів, які були активовані були Квітучі Locus T (FT), яка контролює час цвітіння, і гени, які контролюють ріст рослин і формі листя.