Лабораторная диагностика бактероидозов.

Транспортировка материала в лабораторию

Оптимальным условием для выделения анаэробных аспорогенных бактерий является посев материала на питательные среды непосредственно у постели больного или доставка его в лабораторию в герметических контейнерах, заполненных газовой смесью без кислорода. Однако, это не всегда возможно.

Транспортировку материала в лабораторию осуществляют с соблюдением следующих обязательных условий:

v не допускается длительный контакт с воздухом материала, взятого от больного (включая транспортировку);

v материал в лабораторию следует доставлять в максимально короткий срок (1-2 часа). По телефону бак лаборатория предупреждается о направлении материала на исследование;

v плотный материал транспортируют во флаконах или пробирках, закрытых резиновыми пробками и заложенных транспортной средой (среда наливается на 3/4 объема флакона);

v жидкий материал может быть доставлен в лабораторию в шприце, из которого удален воздух после взятия материала, а игла вкалывается в резиновую пробку;

v для забора материала могут быть использованы тампоны. Материал, забранный тампоном, сразу же погружается в питательную среду или используются тампоны, предварительно пропитанные раствором, состоящим из 10% лизированной крови и 90% ИХН или 10% лизированной крови, 10% глицерина и 80% ИХН. Эти растворы перед употреблением стерилизуют автоклавированием при 1 атм. 20 мин.

При поступлении материала в лабораторию, в первую очередь, обрабатываются пробы, доставленные в шприцах, тампонах, пробирках, которые не содержат питательных сред, а затем остальные.

Методы: I.Бактериологический - основной.

2.Микроскопический.

МЕТОДИКА ПОСЕВА: Если материал доставлен в шприце, то в лаборатории капля материала наносится на плотные питательные среды и рассевается петлей с целью получения изолированных колоний. Производится также посев материала из шприца на дно пробирки с накопительными питательными средами. Если мате риала в шприце мало, то в шприц засасывается питательная среда и затем производится посев. Остатки материала из шприца используют для приготовления мазков для микроскопии.

При доставке в лабораторию кусочков ткани они извлекаются из флакона стерильным пинцетом, на плотных питательных средах делается отпечаток с последующим рассевом, затем материал погружается на дно пробирки с накопительной средой. Методика посева материала с тампона аналогична.

I этап:

I Материал исследуют на наличие анаэробной и аэробной микрофлоры. Посев проводят на следующие питательные среды:

1) для выявления анаэробной флоры → в 2 пробирки мартеновского или пёченочного бульона (т.е. сахарный бульон или среда Китта-Тароцци), при чем одну пробирку после посева прогревают при 80°С в течение 20 мин для обнаружения споровых форм); по 1-ой пробирке полужидкой среды № 1, 2,3 (см. №1 - полужидкая питательная среда института им. И.И.Мечникова, №2 - модифицированная полужидкая среда Китта-Тароцци; № 3 - полужидкая среда на основе сухой среды для выращивания гонококков) молоко, Вильсона-Блер;

2) для выращивания аэробной флоры - по одной пробирке сахарного, простого СПБ и скошенного агара.

PS: Все жидкие и полужидкие питательные среды, предназначенные для анаэробного посева, предварительно подвергают регенерации - прогреванию при 100°С в течение 15-20 мин на водяной бане.

3) одновременно проводят посев на кровяной агар: 2 чашки на выявление анаэробной флоры (одну чашку помещают в атмосферу природного газа или смеси азота, водорода и углекислого газа, другую - в вакуум);

4) для определения антибиотикограммы посев делают на 2 чашки с кровяным агаром: I чашку помешают в анаэробные, другую - в аэробные условия.

Все посевы инкубируют при 37°С.

РS: Желательно в анаэростат дополнительно поместить смесь, состоящую из 5г пирогаллола «А» и 10г углекислого безводного натрия, либо гипосульфит натрия.

IIОдновременно с посевом производят микроскопию как нативного материала, так и препаратов, окрашенных по Граму. Нативные препараты изучают на подвижность, (аспорогенные анаэробы подвижны). Наличие в препаратах, окрашенных по Граму, грам- аспорогенных, расположенных парно, цепочками или в виде нитей, свидетельствует о наличии бактероидов или фузобактерий.

II - этап (2- 3-ий день):

1. Просмотр посевов, приготовление и просмотр препаратов из посевов → предварительный ответ.

2.Учет антибиотикограммы и предварительная информация клинициста.

3.Высев из жидких накопительных сред культур на твердые питательные среды для получения изолированных колоний.

III этап (4-5 день):

I. Просмотр посевов на чашках с кровяным агаром, культивированные в ных условиях , микроскопия колоний, окраска, по Граму.

2.Выделение чистой культуры на среде Китта-Тароцци или № 1,2,3.

IV этап (5-7 пень):

1. Изучение однородности выделенной чистой культуры→ мазок по Граму.

2. И «раздавленную каплю» → подвижность.

РS: Мазок по Граму → высушивают на воздухе и фиксируют в 96° спирте 10-15 мин.

3. Проба на каталазу (на предметное стекло или на чашку Петри наносят 1 каплю 3% раствора перекиси водорода (Н₂О₂),в которой суспензируют изучаемую культуру. Если в течение 3 мин. не появляются пузырьки газ, считают, что микробы не вырабатывают фермент каталазу).

4. Посев на «пестрый» ряд Гисса и др. ферментативные свойства.

Исследуют в системе СИБ или в полужидких средах с углеводами, разлитыми высокими столбиками.

5. Проба на антибиотики - методом диффузии в агар кровяной с применением бумажных дисков, в анаэробных условиях!

V этап:

1.Учет свойств выделенной культуры.

2. Выдача ответа (7-10 день).