Действие физических факторов на микроорганизмы.
Лекция № 10
Влияние факторов окружающей среды на микроорганизмы. Стерилизация. Методы и аппаратура. Контроль качества стерилизации. Понятие о дезинфекции, асептике и антисептике.
На микроорганизмы влияют физические, химические и биологические факторы внешней среды. Физические факторы: температура, лучистая энергия, высушивание, ультразвук, давление, фильтрация. Химические факторы: реакция среды (рН), вещества различной природы и концентрации. Биологические факторы – это взаимоотношения микроорганизмов друг с другом и с макроорганизмом, влияние ферментов, антибиотиков.
Факторы окружающей среды могут оказывать на микроорганизмы благоприятное воздействие (стимуляция роста) и отрицательное влияние: микробицидное действие (уничтожающее) и микробостатическое действие (подавление роста), а также мутагенное действие.
Действие температуры на микроорганизмы.
Температура – важный фактор, влияющий на жизнедеятельность микроорганизмов. Для микроорганизмов различают минимальную, оптимальную и максимальную температуру. Оптимальная– температура, при которой происходит наиболее интенсивное размножение микробов. Минимальная – температура, ниже которой микроорганизмы не проявляют жизнедеятельности. Максимальная – температура, выше которой наступает гибель микроорганизмов.
По отношению к температуре различают 3 группы микроорганизмов:
1. Психрофилы (холодолюбивые). Оптимум – 10 - 15°С, максимум – 25-30°С, минимум – 0-5°С. Это обитатели почвы, морей, пресных водоемов (сапрофиты) и некоторые паразиты: паразиты холодолюбивых животных, некоторые виды иерсиний, клебсиелл, псевдомонад, вызывающих заболевания у человека.
2. Мезофилы. Оптимум – 30-37°С. Минимум – 15-20°С. Максимум – 43-45°С. Обитают в организме теплокровных животных. К ним относятся большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
3. Термофилы. Оптимум – 50-60°С. Минимум - 45°С. Максимум - 75°С. Обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна. Они не способны размножаться в организме теплокровных животных, поэтому не имеют медицинского значения.
Благоприятное действие оптимальной температуры используется при выращивании микроорганизмов с целью лабораторной диагностики, приготовления вакцин и других препаратов.
Тормозящее действие низких температур используется при хранении продуктов и культур микроорганизмов в условиях холодильника. Низкая температура приостанавливает гнилостные и бродильные процессы. Механизм действия низких температур – затормаживание в клетке процессов метаболизма и переход в состояние анабиоза.
Губительное действие высокой температуры (выше максимальной) используетсяпри стерилизации. Механизмдействия – денатурация белка (ферментов), повреждение рибосом, нарушение осмотического барьера. Наиболее чувствительны к действию высокой температуры психрофилы и мезофилы. Особую устойчивость проявляют споры бактерий.
Действие лучистой энергии и ультразвука на микроорганизмы.
Различают неионизирующее (ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света) и ионизирующее излучение (g-лучи и электроны высоких энергий).
Ионизирующее излучение обладает мощным проникающим действием и повреждает клеточный геном. Механизм повреждающего действия: ионизация макромолекул, что сопровождается развитием мутаций или гибелью клетки. При этом летальные дозы для микроорганизмов выше, чем для животных и растений.
Механизм повреждающего действия УФ-лучей: образование димеров тимина в молекуле ДНК, что прекращает деление клеток и служит основной причиной их гибели. Повреждающее действие УФ-лучей в большей мере выражено для микроорганизмов, чем для животных и растений.
Ультразвук(звуковые волны 20 тыс. гц)обладает бактерицидным действием. Механизм: образование в цитоплазме клетки кавитационных полостей, которые заполняются парами жидкости и в них возникает давление до 10 тыс. атм. Это приводит к образованию высокореактивных гидроксильных радикалов, к разрушению клеточных структур и деполимеризации органелл, денатурации молекул.
Ионизирующее излучение, УФ-лучи и ультразвук используются для стерилизации.
Действие высушивания на микроорганизмы.
Вода необходима для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов. Снижение влажности среды приводит к переходу клеток в состояние покоя, а затем и к гибели. Механизм губительного действия высушивания: обезвоживание цитоплазмы и денатурация белков.
Более чувствительны к высушиванию патогенные микроорганизмы: возбудители гонореи, менингита, брюшного тифа, дизентерии, сифилиса и др. Более устойчивы споры бактерий, цисты простейших, бактерии, защищенные слизью мокроты (туберкулезные палочки).
В практике высушивание используется для консервирования мяса, рыбы, овощей, фруктов, при заготовке лекарственных трав.
Высушивание из замороженного состояния под вакуумом – лиофилизация или лиофильная сушка.Ее используют для сохранения культур микроорганизмов, которые в таком состоянии годами (10-20 лет) не теряют жизнеспособности и не меняют свойств. Микроорганизмы находятся при этом в состоянии анабиоза. Лиофилизация используется в производстве препаратов из живых микроорганизмов: эубиотиков, фагов, живых вакцин против туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, гриппа и др.
Действие химических факторов на микроорганизмы.
Химические вещества по-разному влияют на микроорганизмы. Это зависит от природы, концентрации и времени действия химических веществ. Они могут стимулировать рост (используются как источники энергии), оказывать микробицидное, микробостатическое, мутагенное действие или могут быть безразличными для процессов жизнедеятельности
Например: 0,5-2% раствор глюкозы – источник питания для микробов, а 20-40% раствор оказывает угнетающее действие.
Для микроорганизмов необходимо оптимальное значение рН среды. Для большинства симбионтов и возбудителей заболеваний человека – нейтральная, слабощелочная или слабокислая среда. При росте рН сдвигается чаще в кислую сторону, рост микроорганизмов при этом приостанавливается. А затем наступает гибель. Механизм: денатурация ферментов гидроксильными ионами, нарушение осмотического барьера клеточной мембраны.
Химические вещества, которые обладают противомикробным действием, используются для дезинфекции, стерилизации и консервации.
Действие биологических факторов на микроорганизмы.
Биологические факторы – это различные формы влияния микробов друг на друга, а также действие на микроорганизмы факторов иммунитета (лизоцим, антитела, ингибиторы, фагоцитоз) во время их пребывания в макроорганизме. Совместное существование различных организмов – симбиоз. Выделяют следующие формы симбиоза.
Мутуализм– такая форма сожительства, когда оба партнера получают взаимную выгоду (например, клубеньковые бактерии и бобовые растения).
Антагонизм – форма взаимоотношений, когда один организм наносит вред (вплоть до гибели) другому организму своими продуктами метаболизма (кислоты, антибиотики, бактериоцины), благодаря лучшей приспособленности к условиям среды, путем непосредственного уничтожения (например, нормальная микрофлора кишечника и возбудители кишечных инфекций).
Метабиоз– форма сожительства, когда один организм продолжает процесс, вызванный другим (использует его продукты жизнедеятельности), и освобождает среду от этих продуктов. Поэтому создаются условия для дальнейшего развития (нитрифицирующие и аммонифицирующие бактерии).
Сателлизм– один из сожителей стимулирует рост другого (например, дрожжи и сарцины вырабатывают вещества, способствующие росту других, более требовательных к питательным средам, бактерий).
Комменсализм– один организм живет за счет другого (извлекает выгоду), не причиняя ему вреда (например, кишечная палочка и организм человека).
Хищничество– антагонистические взаимоотношения между организмами, когда один захватывает, поглощает и переваривает другой (например, кишечная амеба питается кишечными бактериями).
Паразитизм – форма антагонистических отношений, когда один организм использует другой для обеспечения своей жизнедеятельности как источник питания и среду для обитания с причинением ему вреда (например, бактериофаги – паразиты бактерий).
Стерилизация.
Стерилизация – это процесс полного уничтожения в объекте всех жизнеспособных форм микробов, в том числе спор.
Различают 3 группы методов стерилизации: физические, химические и физико-химические. Физические методы:стерилизация высокой температурой, Уф облучением, ионизирующим облучением, ультразвуком, фильтрованием через стерильные фильтры. Химические методы – использование химических веществ, а также газовая стерилизация. Физико-химические методы – совместное использование физических и химических методов. Например, высокая температура и антисептики.
Стерилизация высокой температурой.
К этому методу относятся: 1) стерилизация сухим жаром; 2) стерилизация паром под давлением; 3) стерилизация текучим паром; 4) тиндализация и пастеризация; 5) прокаливание; 6) кипячение.
Стерилизация сухим жаром.
Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165-170°С воздуха в течение 45 мин.
Аппаратура: сухожаровой шкаф (печь Пастера). Печь Пастера – металлический шкаф с двойными стенками, обшитый снаружи материалом, плохо проводящим тепло (асбест). Нагретый воздух циркулирует в пространстве между стенками и выходит наружу через специальные отверстия. При работе необходимо строго следить за нужной температурой и временем стерилизации. Если температура будет более высокой, то произойдет обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре требуется более длительная стерилизации. По окончании стерилизации шкаф открывают только после его остывания, иначе стеклянная посуда может потрескаться из-за резкой смены температуры.
Материал и режим стерилизации:
а) стеклянные, металлические, фарфоровые предметы, посуда, завернутые в бумагу и закрытые ватно-марлевыми пробками для сохранения стерильности (165-170°С, 45 мин);
б) термостойкие порошкообразные лекарственные средства - тальк, белая глина, окись цинка (180-200°С, 30-60 мин);
в) минеральные и растительные масла, жиры, ланолин, вазелин, воск (180-200°С, 20-40 мин).
Стерилизация паром под давлением.
Наиболее эффективный и широко применяемый в микробиологической и клинической практике метод.
Метод основан на гидролизующем действии пара под давлением на белки микробной клетки. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает высокую эффективность этой стерилизации, при которой погибают самые стойкие споровые бактерии.
Аппаратура – автоклав. Автоклав состоит из 2-х металлических цилиндров, вставленных друг в друга с герметически закрывающейся крышкой, завинчивающейся винтами. Наружный котел – водопаровая камера, внутренний – стерилизационная камера. Имеется манометр, паровыпускной кран, предохранительный клапан, водомерное стекло. В верхней части стерилизационной камеры – отверстие, через которое пар проходит из водопаровой камеры. Манометр служит для определения давления в стерилизационной камере. Между давлением и температурой существует определенная зависимость: 0,5 атм - 112°С, 1-01,1 атм – 119-121°С, 2 атм - 134°С. Предохранительный клапан – для защиты от чрезмерного давления. При повышении давления выше заданного, клапан открывается и выпускает лишний пар. Порядок работы.В автоклав наливают воду, уровень которой контролируют по водомерному стеклу. В стерилизационную камеру помещают материал и плотно завинчивают крышку. Паровыпускной кран открыт. Включают нагрев. После закипания воды кран закрывают лишь тогда, когда будет вытеснен весь воздух (пар идет непрерывной сильной сухой струей). Если кран закрыть раньше, показания манометра не будут соответствовать нужной температуре. После закрытия крана, в котле постепенно повышается давление. Начало стерилизации – тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. По истечении срока стерилизации прекращают нагрев и охлаждают автоклав до возвращения стрелки манометра к 0. Если выпустить пар раньше, жидкость может вскипеть из-за быстрой смены давления и вытолкнуть пробки (стерильность нарушается). Когда стрелка манометра вернется к 0, осторожно открывают паровыпускной кран, спускают пар и затем вынимают стерилизуемые объекты. Если не выпустить пар после возвращения стрелки к 0, вода может конденсироваться и смочить пробки и стерилизуемый материал (стерильность нарушится).
Материал и режим стерилизации:
а) стеклянная, металлическая, фарфоровая посуда, белье, резиновые и корковые пробки, изделия из резины, целлюлозы, древесины, перевязочный материал (вата, марля) (119 - 121°С, 20-40 мин));
б) физиологический раствор, растворы для инъекций, глазные капли, дистиллированная вода, простые питательные среды - МПБ, МПА(119-121°С, 20-40 мин);
в) минеральные, растительные масла в герметически закрытых сосудах (119-121°С, 120 мин);
Стерилизация текучим паром.
Метод основан на бактерицидном действии пара (100°С) в отношении только вегетативных клеток.
Аппаратура – автоклав с незавинченной крышкой или аппарат Коха.
Аппарат Коха -это металлический цилиндр с двойным дном, пространство в котором на 2/3 заполнено водой. В крышке – отверстия для термометра и для выхода пара. Наружная стенка облицована материалом, плохо проводящим тепло (линолеум, асбест). Начало стерилизации – время от закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру.
Материал и режим стерилизации.Этим методом стерилизуют материал, который не выдерживает температуру выше 100°С: питательные среды с витаминами, углеводами (среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина), желатином, молоко.
При 100°С споры не погибают, поэтому стерилизацию проводят несколько раз - дробная стерилизация -20-30 мин ежедневно в течение 3-х дней.
В промежутках между стерилизациями материал выдерживают при комнатной температуре для того, чтобы проросли споры в вегетативные формы. Они будут погибать при последующем нагревании при 100°С.
Тиндализация и пастеризация.
Тиндализация -метод дробной стерилизации при температуре ниже 100°С. Она используются для стерилизации объектов, которые не выдерживают 100°С: сыворотка, асцитическая жидкость, витамины. Тиндализация проводится в водяной бане при 56°С по 1 часу 5-6 дней.
Пастеризация - частичная стерилизация (споры не погибают), которая проводится при относительно низкой температуре однократно. Пастеризацию проводят при 70-80°С, 5-10 мин или при 50-60°С, 15-30 мин. Пастеризация используется для объектов, теряющих свои качества при высокой температуре.Пастеризацию, например, используют для некоторых пищевых продуктов: молока, вина, пива. При этом не повреждается их товарная ценность, но споры остаются жизнеспособными, поэтому эти продукты нужно хранить на холоде.