Экспресс-метод определения количества жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий в ризоторфине на мембранных фильтрах по Шильниковой, Сигуте

При возделывании бобовых культур применяют также препарат ризоторфин — сыпучую массу с влажностью 50—55%, расфасо­ванную в полиэтиленовые пакеты по 200, 400, 600 или 800 г. Ризоторфин для сои и люпина хранят при 12—14 °С, для остальных культур — при 3—5 °С. Срок годности — 6 мес. В 1 г ризоторфина содержится 2,5 млрд. клеток клубеньковых бактерий.

Постановка опыта. Поскольку часть клеток клубенько­вых бактерий адсорбирована в ризоторфине, сначала их десорбируют с торфяных частиц растиранием ризоторфина в 0,1—0,5%-ном растворе пирофосфата натрия или обработкой твином-20 (поверхностно-активным веществом).

Мембранные фильтры № 1 (диаметр пор 0,3 мкм), № 2 (диаметр пор 0,5 мкм) или «Сынпор» (Прага) (диаметр пор 0,23 мкм) маркируют по лицевой (матовой) стороне простым карандашом и кипятят 20—30 мин в дистиллированной воде в открытом химическом стакане с 3—5-кратной сменой воды и начальной температурой 45—50 °С (для предотвращения скручивания фильтров). При кипячении и смене воды проис­ходит стерилизация фильтров, из пор вытесняется воздух и удаляются растворители.

10 г препарата ризоторфина разводят в 90 мл стерильно­го раствора пирофосфата натрия, предварительно растерев его до пастообразного состояния, и делают последовательные раз­ведения. Прокипяченный мембранный фильтр вместе с обыч­ным фильтром из фильтровальной бумаги, также прокипячен­ным, выкладывают на фильтроносную пластинку фильтра Зейтца и закрепляют воронкой. Можно вместо фильтра Зейтца использовать специальные приборы Рублевской водопровод­ной станции. Фильтруют 1 мл раствора ризоторфина опреде­ленного разведения, распределяя его равномерно по всей по­верхности фильтра, при отрицательном давлении — через воронку Бюхнера посредством водоструйного насоса.

Далее бактерии подращивают на среде Исварана: быст­рорастущие клубеньковые — 6—8 ч, медленнорастущие — 18— 24 ч; общую численность микроорганизмов определяют на МПА. С этой целью фильтры маркированной стороной вверх фламбированным пинцетом переносят в чашки Петри, заполненные агаризованными (0,7—1% агара) средами Исвара­на и МПА. На фильтре с диаметром фильтрующей поверхно­сти около 30 мм не должно быть более 50 колоний.

Состав среды Исварана (г/л дистиллированной воды): маннит - 10; К₂НРО₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,2; NaCI - 0.1; глюканат кальция — 1,5; FeCl₃ — 0,01; дрожжевой экстракт — 2; рН 6,8 (устанавливают раствором NaOH). Стерилизуют среду при 0.5 атм. 30 мин, для подавления сапротрофной микрофлоры добавляют 0,01% кристаллического фиолетового.

Колонии на фильтрах окрашивают в течение 5 мин рас­твором акридинового оранжевого (1 : 1000) на фосфатном бу­фере (рН 8), промывают стерильной водопроводной водой 1 — 2 мин. Для хранения фильтры фиксируют в парах формалина, для чего 10%-ный раствор формалина наливают на дно чашки Петри, на крышку которой прикрепляют влажный мембран­ный фильтр с выросшими колониями. Чашку Петри помеша­ют в термостат или на нагревательный столик при 40°С на 15-20 мин.

Перекрашенные фильтры отмывают через влажную фильтровальную бумагу: на фильтровальную бумагу, обильно смоченную водой, помешают мембранные фильтры тыльной стороной на несколько минут. Меняя фильтровальную бумагу, доводят окраску фильтров до нужной степени яркости. Высу­шенные фильтры можно осветлять, нанося на них несколько капель иммерсионного масла.

Анализ. Колонии подсчитывают под люминесцентным микроскопом в сине-фиолетовом свете (объектив 10х, окуляр — любой). Можно считать их визуально с помощью прибора для подсчета колоний, особенно если метод модифи­цируют для подсчета чистых культур клубеньковых бактерий, например, когда необходимо определить дозу инокулюма на препарате. В этом случае через 15—18 ч подращивания быст­рорастущих культур и 36 ч подращивания медленнорастущих их окрашивают 0,25%-ным раствором хризоидина, эозина или 2%-ным раствором эритрозина в 5%-ном растворе карболовой кислоты (феноле) в течение 7 мин.