Метод Виноградского в модификации Теппер
Метод Виноградского
Микроорганизмы, разлагающие гумусовые вещества
Метод обрастания стекол по Холодному
Состав и соотношение почвенных микроорганизмов
Сущность метода состоит в следующем. На ровной поверхности почвы делают ножом разрез, глубина которого зависит от исследуемого горизонта. Отмытые и обезжиренные стекла (одновременно берут несколько стекол) плотно прижимают к вертикальной стенке разреза и засыпают почвой. В пахотном слое стекла помещают на 3—5 см ниже поверхности. Сверху разрез засыпают почвой и место, где заложены стекла, отмечают этикеткой. Стекла выдерживают в почве в зависимости от задачи исследования от недели до нескольких месяцев.
После истечения времени экспозиции убирают почву с тыльной стороны стекол, «откидывают» их от стенки и вынимают. Тыльную сторону вытирают сухой тряпкой, а опытную поверхность стекол высушивают на воздухе и фиксируют трижды, проводя тыльной стороной над пламенем горелки. После фиксации стекло погружают в воду опытной поверхностью вниз, не доводя его до дна. При этом крупные частицы почвы, отмокая, падают на дно, а фиксированные микроорганизмы и мелкие частицы остаются на стекле. После промывки препарат погружают в раствор карболового эритрозина на срок от 30 мин до 24 ч.
Окрашенные препараты исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. При микроскопировании отмечают характер микрофлоры, плотность обрастания стекол и доминирующие формы. Отдельные ассоциации микроорганизмов можно запечатлеть, используя микрофотосъемку.
Для выявления автохтонной — истинно почвенной группы микроорганизмов, минерализующих гумусовые вещества, по Виноградскому отмытые от следов хлора и прокипяченные гелевые пластины пропитывают минеральной средой без источников углерода и азота (г/200 мл дистиллированной волы): К2НРО4 - 1,0; MgSO4 • 7Н,0 - 0,5; NaCI – 0,5; FeSO4 • 7Н,О - 0,01; MnSO4•4H2O - 0,01.
В чашку вносят 3—5 мл минеральной среды, а в качестве единственного источника углерода и азота добавляют гумат кальция.
Чашки Петри с гелевыми пластинами с гуматами и комочками почвы (см. 8.2.1) помешают во влажную камеру крышками вниз и выдерживают при 25—28 °C 40—50 сут и более. Вокруг комочков почвы на гумате появляются специфичные бурые колонии в виде тонких бархатистых налетов розового и белого цвета — Bactoderma (В. alba. В, rosea).
В данной модификации в отличие от основною метода к 3-5 мл минеральной среды добавляют 0,3 г СаСО3, а вместо гумата кальция используют более подвижную и доступную для микроорганизмов форму — гумат натрия 10 – 50 мл. Вместо комочков почвы добавляют 1 мл почвенной суспензии разведения 10-2. Содержимое чашки также тщательно перемешивают, подсушивают до эмалевой поверхности, помещают во влажную камеру и выдерживают при 25—28 °С.
Через 50—60 сут инкубации на поверхности гелевых пластин с гуматами появляются мелкие колонии бурого и желто-бурого цвета. Диаметр отдельных колоний колеблется от 0,5 до 1,0—1,5 мм, а после 4 мес. инкубации — от 1,0 до 2,5 мм. Более крупные колонии микроорганизмов образуются, если гуматы используют только как источник углерода. В этом случае в минеральную среду вносят дополнительно азот в виде KNO3 (14 мг на чашку).
При просмотре колоний под микроскопом с увеличениями х30 (10х — окуляр, 3х — объектив) и х80 (10х — окуляр, 8х — объектив) у многих из них по периферии обнаруживается мицелиальная зона, состоящая из фрагментированных гифов, характерных для представителей рода Nocardia. Припосеве бурых и желто-бурых колоний на нитритный агар (см. 10.2.1) часть их образуют микроорганизмы рода Nocardia, микобактерии и Arthrobacter. Определенная доля бурых колоний на гумате принадлежит представителям Micromonospora.
В более поздние сроки инкубации (через 5—6 мес. ипозже) появляются бактерии рода Bactoderma (В. alba иВ. rosea). Для выявления бактерий этого рода к нитритному агару следует добавить дрожжевой автолизат.
Описанным способом можно изучить микроорганизмы, участвующие в разложении не только гумата натрия, но и фульвокислот. В этом случае к основной минеральной среде, указанной выше, следует добавить 10—50 мг фульвокислот.
Метод Виноградского в модификации Теппер дает возможность изучить сукцессию микроорганизмов,участвующих в разложении гумусовых кислот. С этой целью при постановке опыта чашки с гумусовыми кислотами (фульвокислотами или гуминовыми кислотами), инфицированные почвенной суспензией (10-2), помешают во влажную камеру и в термостат при25—28° С. В разные сроки инкубации (через 2, 4, 6, 8 и 12 мес.) вынимают две параллельные чашки и изучают в них микрофлору.
Поскольку в гумусовых кислотах соотношение С : N < < 25 : 1, то при их разложении выделяется аммиак. Однако аммиак не накапливается, а по мере образования окисляется нитрифицирующими бактериями. Поэтому в процессе окисления гумусовых кислот (через 4, 6 и 8 мес. инкубации) наряду с микроорганизмами автохтонной группы (Nocardia, Bactoderma, Mycobacterium) на гелевых пластинах с гумусовыми кислотами обнаруживаются зоны с клетками Nitrosomonas.