Симбиотические азотфиксаторы

Общие сведения

Азотфиксация

Материалы и оборудование

Питательная среда Гильтая или заменяющая ее среда, прибор для постановки опыта, свежая почва, фарфоровая пластинка с лунками, чайная алюминиевая ложка или шпатель (фарфоровый или металли­ческий), пипетки Мора на 1 мл, дифениламин в концентрированной серной кислоте, цинк-иод-крахмал (или реактив Грисса), 20%-ная H₂SO₄, реактив Несслера, микроскопы и все необходимое для микроскопирования и приготовления окрашенных препаратов.

Процесс фиксации атмосферного азота бактериями имеет большое значение для общего баланса азота в почве. Он входит в число приоритетных научных проблем, определяя в значи­тельной степени достаточность обеспечения растений доступ­ными формами азота.

Ассимиляцию молекулярного азота, имеющую значение для земледелия, осуществляют прокариоты, которых в зави­симости от их взаимоотношений с растением делят на 3 группы.

1. Живущие в симбиозе с растением — симбиотические
азотфиксаторы.

Все они диазотрофы. т. е. могут использовать для пита­ния и молекулярный, и минеральный азот. Ежегодно только на поверхности суши бактерии фиксируют до 200 млн. т азота и от ,30 до 190 млн. т — в водных экосистемах.

Вводные пояснения. Симбиотическая азотфиксация —

это способность бактерий связывать молекулярный азот, нахо­дясь в симбиозе с высшими растениями. Более чем 1300 видов бобовых растений и более 200 видов небобовых древесных и кустарниковых пород (ольха, облепиха, мох и другие) имеют клубеньки на корнях. Некоторые (например, тропическое рас­тение сесбания) образуют клубеньки на корнях и стеблях.

Клубеньковые бактерии относятся к родам Rhizobium (преимущественно), Bradyrhizobium, Azorhizobium и другим.

Внедрившись в ткань корня, эти бактерии распространя­ются обычно в виде инфекционных нитей — колоний размно­жившихся клеток бактерий.

В зрелой клубеньковой ткани бактериальные клетки пре­вращаются в бактероиды. В отличие от бактериальной клетки, имеющей форму палочки, бактероиды — грушевидные, сфери­ческие или ветвистые образования в 3—4 раза более крупных размеров. Зона клубенька с клетками как бактериальной, так и бактероидной формы получила название бактероидной.

Форма и размеры клубеньков разных бобовых растений неодинаковы (рис. 25). У клевера они продолговатые и мелкие, у гороха и вики — округлые и крупные. У фасоли и сои диа­метр клубеньков достигает 1 см, а у люпина иногда — величи­ны грецкого ореха. Разрушение клубеньков сопровождается деградацией элементов растительной клетки и лизисом части

Рисунок 25 - Форма клубеньков бобовых растений: а — чины; б — клевера: в — гороха и вики; г — люцерны; д— люпина

бактероидов, тогда как остальная их часть образует мелкие кокковидные клетки — своеобразные артроспоры, выполняю­щие функцию размножения и сохранения в природе.

При изучении клубеньковых бактерий в световом микро­скопе артроспоры не видны. Их можно обнаружить лишь с помощью электронного микроскопа при большом увеличе­нии.

На питательных средах клетки ризобий — подвижные, не образующие спор грамотрицательные палочки. Среди них встречаются и кокковидные клетки. В старых культурах клетки крупнее, палочковидные, неподвижные, изредка встречаются Т-образные бактероидные формы.

По скорости роста клубеньковые бактерии делят на мед­леннорастущие, например Bradyrhizobium japonicum у люпина, сои, и быстрорастущие — у гороха, клевера и др.

Знакомство с клубеньковыми бактериями. Строение клу­беньков бобовых изучают на срезах, которые делают острой ботанической бритвой или готовят на микротоме. Тонкий срез, продольный или поперечный, помещают на предмет­ное стекло и просматривают в раздавленной капле при раз­ных увеличениях. В сухой системе просматривают структуру клубенька, обнаруживают бактероидную ткань, а затем при достаточной тонкости среза препарат исследуют с иммерси­онной системой, где хорошо видна бактероидная зона клу­бенька.

Для знакомства с формами разных видов клубеньковых бактерий готовят фиксированные и окрашенные препараты из бактероидной ткани клеток клубенька. Если клубенек доста­точно крупный, его разрезают бритвой на две части и поверх­ность среза многократно прокалывают стерильной иглой, вы­зывая возможно большее механическое разрушение клеток. За­тем из него отжимают каплю на предметное стекло и готовят фиксированный и окрашенный препарат.

Мелкие клубеньки (2—3) помешают на предметное стек­ло, добавляют каплю воды, и прижимают другим предметным стеклом. Выдавленное содержимое размазывают по стеклу, ма­зок сушат, фиксируют и красят карболовым эритрозином, фуксином или генцианом фиолетовым.

Хорошая окраска получается при использовании смеси равных частей фуксина и метиленового синего, растворенных в 1%-ном растворе уксусной кислоты. В смеси красок препарат выдерживают 3—5 мин. Ткань клубенька окрашивается в си­ний цвет, а бактерии — в красный. Форму клубеньковых бак­терий, в том числе и бактероидов, у разных бобовых растений следует зарисовать и подписать названия.

Культуру клубеньковых бактерий готовят так. Кусочек корня с клубеньком тщательно промывают в стерильной воде, стерилизуют поверхность клубенька в растворе спирта, затем вновь промывают стерильной водой, раздавливают клубенек в капле стерильной воды и суспензию высевают на бобовый агар или среду Фреда (см. 12.5.1).