Окраска клеток микроорганизмов по Грамму

Вводные пояснения. Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение иода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмов первой группы называют грамположителъными, второй — грамотрицательными.

Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное предметное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них — контрольные, с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае лучше держать в наклонном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая, 96%-ным спиртом в течение 15—20 с. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки.

Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются лишь в цвет дополнительной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры. Некоторые бактерии (протей) окрашиваются грамвариабельно, т. е. часть клеток — как грамположительные, а часть — как грамотрицательные.

Хорошими объектами для окраски клеток микроорганизмов по Граму служат дрожжи, Bacillus mesentericus или Bacillus subtilis (грамположительные) и кишечная палочка Escherichia coli (грамотрицательная).

Метод Грама в модификации Синева. На фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги шириной 3 см, предварительно пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристаллического фиолетового и высушенную. На бумагу наносят 2—3 капли воды и оставляют ее на препарате 2 мин. Далее окраску проводят по вышеописанной методике. Модификацию Синева широко применяют на практике.

Метод Грама в модификации Калины. На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды, помещают в нее минимальное количество клеток микроорганизмов и петлей добавляют 0,5%-ный спиртовой раствор кристаллического фиолетового. Суспензию равномерно распределяют на площади 1 см², подсушивают и фиксируют однократным проведением над пламенем горелки. После этого препарат в течение I мин обрабатывают реактивом, содержащим 10 мл 5%-ного раствора фуксина Пфейфера, 10 мл 10%-ного раствора иода, 10 мл ацетона и 70 мл 0,5%-ного

раствора иодита калия. Затем препарат опускают на мгновение в 96%-ный этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой.