Выделение микроорганизмов - продуцентов антибиотиков
Основными продуцентами антибиотиков являются актиномицеты, плесневые грибы, бактерии. Главным местом их обитания является почва. Для выделения микроорганизмов, образующих антибиотики, берут пробы почвы, высушивают ее до воздушно-сухого состояния и делают высевы на специальные питательные среды.
Для выделения актиномицетов, являющихся основными продуцентами антибиотиков, используют синтетические питательные среды, в которые в качестве источника углерода добавляют крахмал или глицерин. В качестве источника азота в среды добавляют нитратные соли. На этих средах рост бактерий подавляется, а грибы развиваются в малом количестве. Чтобы они росли лучше, нужно подкислить среду до рН = 4 - 4,5. Можно также использовать среду Чапека, агаризированную почвенную вытяжку.
Выделенные культуры микроорганизмов-антагонистов изучают по содержанию в них антибиотических веществ, необходимых для практических целей. При этом методом хромотографии определяют наличие известных антибиотиков. Если обнаруживают новый антибиотик, то вначале осуществляют первичное выделение и химическую очистку антибиотика, определяют его токсичность и химико-терапевтические свойства на животных, зараженных возбудителями различных заболеваний.
Выделенные штаммы-продуценты антибиотиков часто вариабельны и нестабильны. Поэтому методом селекции отбирают наиболее перспективные штаммы, а затем проводят отбор индуцированных мутантов. Мутантное действие на микроорганизмы достигается применением различных источников лучистой энергии (УФ-лучи, рентгеновские лучи, нейтроны и др.).
Культивируют мутантные штаммы на богатой питательной среде. Процесс контролируют либо по концентрации биомассы, либо по концентрации питательных веществ в среде.
Биосинтез молекулы любого антибиотика происходит с участием ряда ферментов - от нескольких единиц до нескольких десятков. Координация действия ферментов, т.е. обеспечение правильной последовательности ферментативных реакций, обеспечивается разными, не всегда еще ясными путями.
Процесс развития микроорганизмов (продуцентов антибиотиков) имеет, как правило, двухфазный характер.
Первая фаза развития (трофофаза, или фаза сбалансированного роста) характеризуется тем, что в культуре продуцента антибиотика происходит быстрое накопление биомассы, сопровождаемое интенсивным потреблением основных компонентов субстрата (источников углерода, азота, фосфора и др.), некоторым снижением значения рН среды в результате образования кислых продуктов. Биосинтез антибиотика в этот период не происходит или осуществляется в незначительном количестве.
Вторая фаза (идиофаза - фаза несбалансированного роста) характеризуется снижением общего количества биомассы. В период второй фазы происходит развитие микроорганизма и образование новых клеток, но в культуре начинают преобладать автолитические процессы, что приводит к снижению общего числа биомассы. Среда обогащается продуктами обмена и продуктами автолиза клеток, возрастает значение рН, происходит бурный процесс биосинтеза антибиотика.
По окончании приготовления антибиотиков их проверяют на активность по отношению к тест-штаммам.
Методов определения активности антибиотиков много. Но главными из них являются микробиологические.
Способность убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов называют биологической активностью препарата. В связи с этим различают цидное и статическое действие веществ. Например, антибиотики обладают фунгицидным, бактерицидным действием или фунгистатическим и бактериостатическим действием.
Для количественного определения активности антибиотика введено понятие единицы действия (ЕД). При определении активности выделенного антибиотика обычно в качестве эталона используют химически чистый препарат с заранее известной величиной активности.
ЕД - это активность определенного весового количества антибиотика, принятого за эталон.
Так, ЕД пенициллина - это минимальная доза, подавляющая рост тест-штамма золотистого стафилококка в 50 мл питательного бульо-
на. Если чистый кристаллический пенициллин задерживает рост золотистого стафилококка в разведении 1 : 83000000, то в 1 г антибиотика содержится 1666000 ЕД (83000000 : 50 = 1666000) или 1666 ЕД в 1 мг.
Определение активности антибиотика проводят методом его серийных разведений в жидких или плотных питательных средах, а также методом диффузии антибиотика в агаре.
Кроме микробиологического метода контроля применяют химические и физико-химические методы: колориметрический, хроматог-рафический, спектрофотометрический.