З клетки в пыльце

• 1 крупная с вегетативным ядром

• активная транскрипция транспозонов, siRNA мало

• 2 мелких sperm cells, обогащены siRNA, транспозоны подавлены

• Вегетативная клетка поставляет siRNA в sperm cells

Имеется яйцеклетка и центральная диплоидная клетка. Все это образуется в результате митотических и отдельных мейотических делений. Одна клетка спермия будет сливаться с яйцеклеткой, а другая – с центральной диплоидной клеткой, образуя эндосперм. В вегетативном ядре осуществляется активация транспозонов за счет того, что осуществляется деметилирование ДНК. Подробно, как осуществляется деметилирование, мы рассматривать не будет, так или иначе, осуществляется транскрипция транспозонов. Выше было показано, как из транскриптов транспозонов может образовываться siРНК размером 21 нт. Далее siРНК из вегетативного ядра интенсивным образом перекачивается в ядро спермы, где siРНК участвует в подавлении транскрипции транспозонов и метилировании ДНК транспозонов. Это делается для того, чтобы сохранить геном спермиальной клетки от воздействия транспозонов, вызывающих двунитевые разрывы. В вегетативной клетке (ее геном не идет на образование зародыша) такое безобразие может осуществляться. Сходные вещи происходят в центральной диплоидной клетке, которая даст эндосперм (который по сути питательная ткань для развития организма). Если здесь будет осуществляться активация транспозонов (геном этой клетки ограничен только функционированием эндосперма) то не так страшно, если с участием транспозонов в нем возникнут небольшие неприятности. Далее показано, что функционирует полимераза IV, накапливается 24 нт siРНК, которая является мобильной и перекачивается из центральной клетки в клетку, которая содержит ядро и будет участвовать в оплодотворении спермием. И здесь уже будет осуществляться подавление транспозона. Видим разделение труда между клетками компаньонами и герминальными клетками. Эти «компаньоны» обслуживают геном растения, который будет потом формировать зародыш. В этом случае, материнская клетка, которая центральная клетка, создает достаточно много siРНК и обеспечивает функционирование siРНК в геноме, который будет оплодотворен спермием и который даст развитие зародыша. Это похоже на процесс у дрозофилы, когда в материнском организме накапливалась siРНК для того, чтобы обеспечить подавление мобильных элементов.

Поскольку мы говорим о том, что эти siРНК могут перемещаться, то нужно сказать о том, как это удается наблюдать. Образование siРНК это и есть определенный сигнал для осуществления сайленсинга генов на уровне хроматина или пост-транскрипционном уровне.

Создаются определенные конструкции, которые будут нести зеленый белок. Есть мощный промотор, две последовательности гена зеленого белка, которые смотрят друг на друга. Когда это все транскрибируется, образуется шпилька, которая процессируется и дает короткие РНК. В организме, от которого взята соответствующая корневая система, накапливается сайленсер в виде коротких РНК. Он дальше прививается на развивающиеся растения и смотрят, что будет происходить. Т.о. в растении работает ген, которая дает зеленый белок. Если облучать растения синим светов или ультрафиолетом, то если зеленый белок нарабатывается, будет видно яркое зеленое свечение. Если белка нет, то в УФ будут светиться каротиноиды и другие пигменты, будет виден красный цвет. Если из корневой системы поступает соответствующий сигнал, который может распространяться достаточно далеко по растению для пост-транскрипционного сайленсинга или транскрипционного сайленсинга, то будет наблюдаться следующая картина. Листья остаются зелеными, если успели вырасти до того, как все стало поступать интенсивно снизу вверх. Листья становятся красными, если образовались из той ткани, куда поступил соответствующий сигнал, где зеленый белок был подавлен. Если сигнал поступил в меристемную клетку то после того, как она начнет делиться, все потомство его унаследует.

PRC, polycomb repressive complex (PRC1,PRC2).Основные свойства:

• Мультисубъединичный комплекс(ы)

• Связывание с участками ДНК, обедненными нуклеосомами, которые транскрибируются (нкРНК)

• Связывание с нк РНК - привлечение комплекса

• “Запись” новых модификаций гистонов

• “Чтение” модификаций гистонов

Показано, что имеется некая нкРНК, туда привлекаются белки комплекса РRС, и если ее будем уничтожать с помощью РНК-интерференции, то привлечения комплекса к хроматину не будет. Фактически два комплекса PRC2 /PRC1 могут работать независимо друг от друга, а могут работать в комплексе вместе. Три белка, которые входят в состав комплекса, обеспечивают активность одной из субъединиц (каталитическая), которая осуществляет образование метки Н3К27me3. Эта неактивная метка присутствует в эмбриональных стволовых клетках. В частности, благодаря тому, что там действуют эти комплексы, осуществляется поддержание стволовые клетки, как стволовой, т.е. плюрипотентная клетка не идет в дифференцировку и может сохранять свойства. Субъединица, которая осуществляет каталитическая метилирование работает только в комплексе. Она сама по себе не активна. Кроме того, к этому основному ядру этих субъединиц у млекопитающих, может присоединяться ДНК-метилтрансфераза, и даже с этим комплексом может слабо связываться ДНК-деметилаза этой метки. Это показывает, что этот комплекс может менять свою конформацию за счет внешних агентов, т.е. меняет свои свойства от способности осуществлять метилирование до способности осуществлять деметилирование. Вместе с комплексом РRС2 может работать комплекс РRС1, который узнает соответствующий метку. РRС1 комплекс в своем составе имеет лигазу, которая осуществляет присоединение убиквитина к гистону Н2А (Н2А-убиквитинлигаза). Эта модификация является дополнительным репресссорным фактором. Транскрипты, которые находятся около старта или перекрываются со стартом мишени белок-кодирующего гена (который будет подавляться этими комплексами), привлекают эти комплексы. Т.е. мишень, которая будет подавляться этим комплексом, транскрибируется, из этого транскрипта образуется мРНК для соответствующего белка. Оказывается, что вокруг старта транскрипции этого предшественника имеется старт отдельных транскриптов, располагающийся на расстоянии до старта транскрипции этой мРНК и после него. Они являются тем, что заставляет связываться комплекс РRС и привлекают его к хроматину. Короткие транскрипты генов - мишеней комплекса PcG, cвязывающих PRC2, обладают следующими свойствами:

• Старт этих транскриптов -700 +700 нт перед стартом транскрипции мРНК; образуются независимо от мРНК мишени

• Связывание комплекса PRC2 c короткими транскриптами (50-200 нт), непродуктивной PНК пол II в паузе

• Такое взаимодействие препятствует продуктивной элонгации транскрипции

Взаимодействие комплексов РRС1 и РRС2

Есть одна половинка этого большого комплекса PcG, которая делает соответствующую репрессорную метку, и вторая половинка, которая эту метку узнает и делает еще вторую репрессорную метку. Узнавание метки осуществляется с помощью субъединицы Рс2. Причем, для того, чтобы осуществлялось достаточно прочное связывание комплекса с модификацией, должно осуществляться сумоилирование (присоединение короткого белка, отличающегося от убиквитина, меняющая свойства этой субъединицы и дающая свойство узнавать эту модификацию). Комплекс у млекопитающих заметно сложнее, чем у дрозофилы, где он впервые начал изучаться. Имеется ряд гомологичных субъединиц, которые иногда называются по иному, а иногда несут название похожие на те, которые имеются у дрозофилы.

нкРНК привлекает комплекс РRС2 и обеспечивает его связывание. Кроме того, эта нкРНК может участвовать в изменении аллостерических конформаций субъединиц. Целый ряд субъединиц этого комплекса непосредственно взаимодействует с ДНК, т.е. это ДНК-узнающий белок. Некоторые субъединицы получили названия, которые говорят о значимости этого комплекса. Например, EED (Embryomic Endoderm Development) субъединица участвует в распознавании метки Н3К27me3. Комплекс РRС2 играет огромную роль в развитии. Сначала комплекс был обнаружен, как необходимый для становления плана тела дрозофилы (Polycomb это гребешок). При нарушении образования этого комплекса, так распределение половых мешков на лапках самца дрозофилы меняется, их становится больше, отсюда такое название. Этот комплекс важен для стволовых клеток, для эмбрионального развития, в случае канцерогенеза он меняет свои функции, нарушения комплекса ведет к изменению распределения по разным генам соответствующих белков, ведет к метастазированию и всяческим неприятностям. Важны связывания с ДНК, пост-трансляционные модификации, с нкРНК, для того чтобы этот комплекс образовывался и вел себя должным образом.

А теперь как модификация Н3К27me3 узнается субъединицами комплекса. Моделируется какой-то фрагмент пептида гистона Н3 (хвостик). Субъединица, которая узнает это, состоит из отдельных повторов, которые в основном имеют бета-структуру, и на внутренней (относительно колец из повторов) пространстве этой субъединицы локализованы ароматические АК (ароматическая клетка из определенных АК), они узнают хвостик.

Эпигенетическое наследование (наследование состояния хроматина). Имеется хроматин, репрессорная метка, осуществляется репликация. На обеих новообразованных нитях ДНК формируются нуклеосомы, которые могут не содержать этой метки. Но старые нити, содержащие метку, могут узнаваться субъединицей EED, а каталитическая субъединица этого комплекса (активна только в составе комплекса) будет метилировать соседнюю нуклеосому и вносить соответствующую метку. Представляется, что в этом случае комплекс может достать и нуклеосому, которая находится на другой нити реплицированной ДНК. В результате образуются уже обе нити, которые являются одинаково метилированными. Структурная и физическая основа самоподдержания эпигеномной метки: PRC2 не только узнает репрессорную метку, но и способствует ее амплификации и распространению.

Участие комплекса в жизни клетки и организма. Как осуществляется эпигенетическая инактивация опухолевого супрессора при сверх-экспрессии LINC, ANRIL, СIS – действие.

Когда были проведены исследования, касающиеся вопроса о том, с какими изменениями нуклеотидной последовательности ассоциированно возникновение опухоли, то оказалось, что в определенном районе человеческой хромосомы находится ряд опухолевых супрессоров – это гены, которые ингибируют cdk. Сdk таким образом способствуют клеточной пролиферации, опухолевому росту. Какие еще есть сайты, ассоциированные возникновением опухоли? Оказалось, что это замена в белок-кодирующей области, которая находится на достаточном расстоянии от белок-кодирующих генов в межгенном районе (где вроде бы генов нет). В дальнейшем оказалось, что если гены опухолевых супрессоров, кодирующие соответствующие белки, транскрибируются в основном в одном направлении, то в противоположном направлении осуществляется транскрипция длинной нкРНК, которая получила название ANRIL. Транскрипция идет в направлении противоположном смысловому, поэтому она называется антисмысловой нкРНК. ANRIL приманивает комплекс PRC2 и РRС1. Условно показано, что это осуществляют какие-то петли, структурные компоненты РНК. Интересно, что в состав комплекса РRC1 входит субъединица, которая может участвовать во внесении определенной модификации гистона, но в тоже время является РНК-связывающим белком. Это субъединица участвует в распознавании, связывании РНК и внесении модификации хроматина. Белок также имеет хромодомен, который узнает метку. Это является достаточно важным, и раньше не привлекало внимание, но сейчас привлекает и показывает, что это все очень важно, чтобы соответствующие домены имели полифункциональные свойства.

Здесь показаны исследования такого хромодоменного белка, которые начались давно. Но практически только недавно был сделан акцент на то, что эти белки могут связывать РНК. Эти белки имеют множество вариантов, но структура их эволюционно консервативна. Т.о. имеется хромодомен, который обозначен как читатель, он прочитает определенную метку, на N-конце терминальный домен. Имеется другой домен, который обеспечивает димеризацию этих белков, что при образовании гетерохроматина может быть достаточно важно (для распространения этих белков по гетерохроматину). Между ними есть домен, представляющий собой связку. Показано, что он интенсивно связывается с РНК. Здесь имеет место электростатические взаимодействие. Зеленым показаны лизины и аргинины на последовательности. Если их смутировать, то все РНК- связывающие свойства это белка исчезнут. Наряду со специфическими взаимодействиями имеет место и неспецифические РНК-связывающие взаимодействия.

Теперь мы возвращаемся к комплексу Polycomb. Эти комплексы не существует только как отдельные комплексы, в пространстве ядра они образуют определенные тельца. На одном из предыдущих лекции были Polycomb тельца. Было показано, что эти репрессорные комплексы, если они находятся в самых разных местах одной хромосомы , в пространстве ядра имеют тенденцию соединятся в один общий комплекс. И тогда репрессия, осуществляемая этими комплексами становится достаточно интенсивной. Причем объединяться могут Polycomb комплексы, находящиеся как на одной хромосоме (достаточно далеко друг от друга), так и на разных хромосомах. Руководящим белком в таких соединениях служит белок инсуляторов. Таким инсуляторным белком считается белок CTCF, с цинковыми пальцами, которые связываются с ДНК, кроме того, он может димеризоваться и любит связываться с когезином (этот белок является главным в определение пространственной структуры хромосомы). На картинке: с помощью антител к определенным субъединицам комплекса показано распределение телец в эмбриональных стволовых клетках, где комплексы Polycomb достаточно важны. Показано распределение субъединицы Рс2 (последняя картинка). Смотрим на картинку, обращаем внимание на Polycomb комплекс и ядерные спеклы (speckles).

Cейчас посмотрим, как осуществляется (и как участвует нкРНК) в перемещении неких генных районов из неактивных состояний в составе телец Polycomb в спеклы, где они активируются. Эти комплексы достаточно динамичны, и меняются под влиянием сигналов поступающих клетку. На картинке справа видим тельца Кахаля. Картинка в основном демонстрируют животную клетку. У растений метилирование ДНК осуществляется в основном в тельце Кахаля.

Регуляция программы клеточного роста с помощью длинных межгенных нкРНК LINC и как они участвуют в распределении субъединицы Pс2.

Pс2 может метилироваться, по лизину в положении 119. Надо сказать, что АК окружение этого лизина похоже на то, которое имеет место вокруг метилированных лизинов в гистоне. Субъединица оказывается метилированной, когда она находится в тельцах Polycomb и деметилированной, когда она обнаруживается в спеклах, где находятся факторы сплайсинга и другие компоненты. На картинке красные и зеленые пятна совпадают. Красные - это распределение метилированной Рс2, зеленые - распределение по тельцам некой нкРНК. В неактивном состоянии, Рс2 связан с этой субъединицей. Схематически: нкРНК присоединяет какие-то ко-репрессоры, она связана с комплексом Поликомб, в этом комплексе нас интересует только субъединица Рс2, регулятор участка некого гена, определяет транскрипцию этого гена. Благодаря тому, что здесь субъединица поликомб (сумоилирована) транскрипции нет. (Сигнал о том, что клетка находится состояния покоя G0). Дальше идет некий сигнал, например в g0 клетка находится когда она без сыворотки, когда добавляем сыворотку, в ней есть сигнал митотического роста и далее осуществляется уничтожение сумоилирования и происходит (под влиянием сигнала) деметилирование этой субъединицы. Это ассоциировано с тем, что поликомб комплекс и эта субъединица перейдут из соседства с этой нкРНК в соседство с другой нкРНК (MALAT), активность которой неободима для активного деления клетки. Деметилированная субъединица переходит в состав спеклов.

Следующие схема показывает, что длинные нкРНК являются платформами разных субядерных структур, которые дают комплексы с регуляторным белком, субъединицей большого комплекса. Здесь показано объединение нкРНК в спеклах, что приводит к тому что в составе таких комплексов активна убиквитинкиназа Н2В (позитивная метка). В спеклах экспрессируются неоходимые для S-фазы гены. Неактивное состояние изображено внизу (нкРНК, метилированная субъединица, все это в поликомб боди). В случае мутагенного сигнала - метилирование. При антимутагенном сигнале - переход обратно. В метелированном и деметилированном состоянии она меняет свою конформацию и специфичность. Это Рс2 субъединица выступала как читатель определенной модификации. Было показано, что она может читать Н3К9me3. Эта же субъединица может читать неактивную и активную модификации, в зависимости от того, метилирована она или нет. Это интересный способ, когда изменение конформации субъединицы меняет ее свойства, показывает мобильность и пластичность.