Апоптоз и некроз клеток

Методы контроля биомассы и количества клеток при культивировании.

Лекция № 27

І. Тема:Потенциометрические методы контроля рН среды и ионного состава культуральных сред. Контроль концентрации субстратов и биотехнологических продуктов.

ІІ. Цель: Ознакомить студентов с потенциометрическими методами рН среды и ионного состава культуральных сред и рассказать о контролях концентрации субстратов, биотехнологических продуктов.

ІІІ. Тезисы лекции:

Под определением биомасса подрозумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твердой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы – подсчет клеток с определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объему осаждения в центрефужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод – бромсульфалеиновая проба, основанная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физико-химическими методами: кондуктометрически (по удельной электропроводимости), спектрофотометрически, колометрически, нефелометрически.

Гибель клеток ведет в выделению клеточных фрагментов, загрязняющих фильтры и пробы, высвобождению внутриклеточных ферментов.

Гибель клеток идет по двум механизмам: апптоз и некроз.

Погибать могут, казалось бы, жизнеспособные клетки, т.е. те, которые еще не успели исчерпать, свои жизненные ресурсы. Зачастую активную роль в своей гибели играет сама клетка – с помощью содержащихся в ней механизмов, которые лишь запускаются теми или иными факторами внеклеточной или внутриклеточной среды; в результате возникло представление об апоптозе или программированной клеточной гибели. Апоптоз определяют, как программируемую клеточную смерть, понимая под этим такую гибель клетки, в развитии которой активную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы.

Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает опадание листьев.

Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма щирок, их можно представить двумя группами:

- «неудовлетворительное»состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри;

- «негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»).

О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свидетельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения дефектных клеток. Важнейший инстумент апоптоза – цитоплазматические протеазы, ядерные эндонуклеаы, последние разрушает ДНК не до нуклеотидов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К прочим «орудиям» апотоза относится совокупность сильных окислителей – избыточное накопление не только оксида азота, но и других ракционноактивных веществ – супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превращает супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элиминирующие из среды пероксид водорода.

Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым – это уже некроз.

Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апоптическому, либо по некротическому пути.