Методы получения протопластов микроорганизмов и оценки их выхода
Протопласты микроорганизмов
Протопласт ― клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие живой клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:
· невысокая производительность;
· можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом;
· трудоемкость и длительность.
Другой метод выделения протопластов ― энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий.
Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:
· одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток);
· клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу;
· клетки не повреждаются;
· метод сравнительно быстрый.
Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.
Выделение протопластов проводят в три этапа:
1. обработка ферментами;
2. выделение протопластов из клеточных стенок;
3. отделение интактных протопластов от клеточных осколков.
Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.
Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт «голый», один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl2, KCl) в концентрации 0,3-0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.
Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.
При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.
Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 оборотов в минуту. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.
Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.
В случае проведения протопластирования по ферментативному методу в негипертонической среде формируются колонии, образованные клетками, на которые не воздействует лизоцим, потому что по причине осмотического шока все протопласты лопаются в отсутствие осмотического стабилизатора. В гипертонической среде колонии образуют клетки, на которые не воздействует лизоцим, а также протопласты, которые смогли в присутствии осмотического стабилизатора регенерировать клеточную стенку. Подсчитывают количество колоний и рассчитывают исходную концентрацию клеток в культуре, концентрацию протопластов и концентрацию регенерировавших протопластов.
Концентрация протопластов рассчитывается как разность между концентрацией исходных клеток (Кисх) и концентрацией клеток, которые не попали под воздействие лизоцима (Косм).
Концентрация протопластов, которые регенерировали клеточную стенку, рассчитывается как разность между концентрацией клеток двух типов на гипертонической среде (Крев) и величиной Косм.
Выход протопластов (В) ― это отношение концентрации протопластов к концентрации исходных клеток:
(1)
Эффективность реверсии протопластов в клеточные формы (ЭР) ― это отношение концентрации протопластов, которые смогли регенерировать клеточную стенку, к общей концентрации протопластов:
(2)