Тема 7. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК

Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции

Аттенуация осуществляется на уровне трансляции путем образования альтернативных шпилек на и-РНК, проходящей через рибосому. Этот тип регуляции обнаружен у E. coli Ч.Яновским в 1983 г. при трансляции полицистронной и-РНК, считанной с оперона trp и содержащей гены ферментов, обеспечивающих синтез триптофана.

Образуемая в оперона trp и-РНК содержит на 5^/-конце лидерную последовательность, включающую повышенную долю кодонов для той аминокислоты (триптофана), синтез которой определяется данным опероном. Если в клетке недостаточно триптофана, то и-РНК своей лидерной последовательностью проходит через пептидильные и аминоацильные центры рибосомы «вхолостую», так как к месту синтеза не подходят нагруженные триптофаном т-РНК. В этом случае в лидерной последовательности, прокатанной через рибосому, за счет палиндрома формируется «шпилька», однако в области структурных генов альтернативная шпилька не образуется. Поэтому основная структурная часть и-РНК беспрепятственно транслируется с образованием ферментов, необходимых для синтеза триптофана.

Если же в клетке имеется избыток триптофана и к рибосомам подходят нагруженные триптофаном т-РНК, то лидерная последовательность транслируется, зато шпилька образуется в зоне структурных генов, что приводит к преждевременной терминации трансляции. В результате этого ферменты синтеза триптофана не образуются и синтез самого триптофана прекращается.

Механизм аттенуации обнаружен не только в оперонах биосинтеза аминокислот, но также при синтезе бета-лактамазы у E. coli.

(ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ)

Генная инженерия– одно из направлений молекулярной биологии и генетики, целью которого является получение с помощью специальных єкспериментальных приемов организмов с новыми свойствами, в том числе не встречающимися в природе. Генная инженерия базируется на манипулировании in vitro с фрагментами нуклеиновых кислот, что позволяет получать рекомбинантные ДНК (рек-ДНК) и на их основе – рекомбинантные (трансгенные) организмы. Генная инженерия – это научная база современной биотехнологии.

В арсенале генной инженерии на настоящий момент имеется множество разнообразных методов, включая классические генетические, молекулярно-генетические, биохимические, физико-химические, цитологические, иммунологические, информационно-аналитические и другие. Следует отметить, что наиболее важными из них являются молекулярно-генетические методы, позволяющие с помощью специальных ферментов рестриктаз получать фрагменты ДНК и встраивать их в хромосомы практически любых организмов – вирусов, бактерий, растений, животных и даже человека. При получении рек-ДНК и рекомбинантных организмов в зависимости от принадлежности исходного организма к тому или иному царству живых существ используются разные комбинации методов, однако стандартная генно-инженерная технология включает следующие основные этапы:

· I этап – получение генов или фрагментов ДНК для последующего встраивания в хромосому реципиента;

· II этап – встраивание генов или фрагментов ДНК в вектор, т.е. в молекулу-переносчик – конструирование вектора;

· III этап – введение рекомбинантного вектора (в который уже встроен “нужный ген”) в клетку реципиента, которой хотят придать новые свойства;

· IV этап – отбор (селекция) молекул рек-ДНК и клеток, несущих рекомбинантную ДНК с помощью селективных маркеров;

· V этап – клонирование рекомбинантных ДНК и рекомбинантных организмов, создание банков генов и клонотек.

Рассмотрим подробнее перечисленные этапы генно-инженерной технологии и применяемые при этом методы.