Транслокация.
Призвана вернуть ситуацию к стабильности. Прекратить метания ССА концов. Призвана сделать рибосому компетентной к следующей стадии. Транслокация - синхронное перемещение двух тРНК и мРНК внутри рибосомы, результатом которого является помещение ППтРНК из А-сайта в Р, деацилированной тРНК из Р-сайта в Е и перемещение мРНК на 3 нуклеотида в сторону 5’-конца.
Этот процесс удивителен, так как мы занимаемся миром молекул, которому присуще квантовое описание. А здесь молекулы столь громадны, что начинают подчиняться не только квантовой теории, но и классической механике. То есть это движение огромных с точки зрения микромира масс, которое осуществляется согласованно и направленно.
Транслокация катализируется специальным белком – второй фактор элонгации (у бактерий EF-G). Это тоже ГТФ-связывающий белок, который приходит на рибосому в претранслокационном состоянии (когда ССА концы мечутся) связывается с рибосомой, после чего гидролизует ГТФ и уходит. Результатом такого связывания и гидролиза ГТФ является транслокация – перемещение двух тРНК и мРНК.
Структура (РСА) для этого белка:
Белок довольно крупный, у него около 700 АК, молекулярный вес 80кДА. Целых 5 доменов: 1 домен – ГТФ-связывающий. 1 и 2 домены очень похожи на 1 и 2 домены фактора Tu, а вместо 3 домена Tu у фаткора G имеется пятый, который не похож на 3 домен Tu, но в целом тройка этих доменов по своей ориентации очень сильно напоминает тройку доменов фактора Tu. Функции этих доменов тоже схожи: они связываются с фактор-узнающим районом рибосомы, они гидролизуют ГТФ (правда, без рибосомы не гидролизуют, только в связанном с рибосомой виде). Домены 3 и 4 характерны только для этого белка. У 3 есть гомологи. А 4 домен вообще редкость в белковом мире, его бэта-тяжи параллельны (очень необычно), и именно это отличает этот фактор от Tu, то есть именно им следует прописать особую роль в транслокации.
Сравнение (слева EF-G, а справа Tu а ААтРНК и с негидролизуемым аналогом ГТФ):
4 домен очень похож на составную спираль из дигидроуридиловой и антикодоной частей тРНК. А 3 домен и кусочек 4 напоминает другую составную спираль L-образной тРНК. Это сходство позволяет говорить о молекулярной мимикрии, то есть наш EF-G прикидывается тРНК. То есть он этим своим выступом проталкивает тРНК и кодон-антикодонвые дуплексы по рибосоме. Прямого проталкивания в мире молекул быть не может, но частично именно так. Были получены рентгеновские данные показали, что этот выступающий 4 домен действительно контактирует с декодирующим сайтом рибосомы. Рентгеновские данные есть, но не все объяснено. Но некоторое можно сказать: связывании G-фактора с рибосомой прекращает движения ССА концов, они наконец-то успокаиваются в гибридном положении и в классическое больше не возвращаются. Еще связывание G прекращает движение субъединиц друг относительно друга (малая двигается относительно большой против часовой стрелки на 6 градусов, это движение возвратно-поступательное – она поворачивается и откидывается назад). G фактор фиксирует ее в развернутом на 6 градусов положении. В какой момент происходит транслокация (тут он говорит транспептидация, но, наверное, ошибся) по отношению к гидролизу ГТФ точно пока не установлено. Ясно только, что гидролиз ГТФ нужен, чтобы изменить конформацию фактора, чтобы он потерял сродство к рибосоме и ушел, и только тогда транслокация может быть закончена тем, что из Е-сайта уйдет деацилированная тРНК и возможно станет связывание новой ААтРНК в А-сайте рибосомы.
Еще раз о трансклокации при наличии EF-G:
Как меня достало это писать =((
Транспептидация, далее разомкнутая рибосома и субъединицы могут двигаться, вот малая и двигается. ССА концы осциллируют между гибридным положение и классическим. Связывание фактора элонгации в комплексе с ГТФ останавливает малую субъединицу и прекращает миграцию ССА концов. При этом 4 домен фактора контачит с декодирующим центром рибосомы, поэтому на схеме это названо А со звездочкой. Далее происходит структурная перестройка, в итоге гидролиз ГТФ и 30S получает возможность опять двигаться (вернуться в исходное классическое положение), при этом транслокация происходит и тРНК занимают свои классические сайты. ГДФ и G уходят, оставляя рибосому в классическом состоянии. Она уже может выпустить деацилированную тРНК и захватить новую в А-сайт.
Опыты в пробирке показали, что G фактор можно исключить из транслирующей системы. Рибосома может транслоцировать без катализатора.
Это бесфакторная спонтанная транслокация. Она медленная, но ее можно ускорить до обычных скоростей (с G-фактором), если, например, выдрать из малой субъединицы S12 белок, или можно SH группу этого же белка модифицировать ртутным производным – парахром??(легколе/мерколе)бензоатом, или можно просто понизить концентрацию Mg. Это говорит о том, что не белковый фактор приносит в рибосому транслокационную активность, эта активность – имманентное свойство рибосомы. Кроме того, процесс транслокации – процесс термодинамически выгодный, который идет с понижением химического потенциала.
Еще прочитайте 3 следствие.
Исследователи не остановились на этом, исключать, так исключать. Оказалось, что можно исключить и фактор 1 (Tu):
Если его исключить, то тРНК сама будет связываться с А-сайтом рибосомы, медленно, но точно. То есть рибосома и без факторов может весь этот цикл делать, что было показано и на полиуридиловой кислоте, и на гетерополимерах. Синтез полипептида, в общем, может и без этих двух факторов. Его можно даже сделать эффективным, если менять концентрацию магний. Бесфакторное связывание тРНК с А-сайтом тоже завиист от магний, но здечь уже хорошо, если магний много. Поэтому для связывания нужно магний поднять, а для транслокации магний надо опустить, тогда все быстро. А вот изменение концентрации магний – источник энергии для этого процесса.
Итак, возможный сценарий элонгационного цикла без участия факторов элонгации:
Рибосомы смотрят на нас головами. В Р-участке ППтРНК. Рибосома разомкнута: 30S движется относительно 50S (те самые 6 градусов), приходит ААтРНК, связывается с А-сайтом (не с первого раза, разумеется). Из-за отсутствия Tu этот процесс медленный, несколько подходов, прежде чем связаться. Рибосома все аккомодирует потом (тРНК установила контакт с кодоном, узнается специальным механизмом в 30S субъединице и зажимается кодон-антикодоновый дуплекс с помощью 30S). Это зажатие происходит из-за того, что голова малой субъединицы наклоняется вперед, к большой субъединице с небольшим поворотом в сторону фактор-связывающего участка. И вот это вот движение в ответ на появление правильного кодон-антикодонового дуплекса приводит к тому, что пришедшая тРНК зажимается в районе малой субъединицы и там фиксируется. Остальное тело в А-сайте, а ССА конец устанавливается правильным образом в ПТЦ. При этом с рибосомой соединились уже два субстрата, и она смыкается, становится компактнее и плотнее. Это необходимо для того, чтобы лишить субстраты подвижности и установить их жестко и правильно. После этого происходит образование пептидной связи. Далее субстраты не на тех местах, рибосоме это не нравится и она вновь размыкается, позволяя миграцию ССА концов и вращательное движение 30S лотносительно 50S. Потом транслокация, медленно без фактора. Медленно, наверное, из-за того, что тоже не с первого раза. Рибосома движется потому, что она находится при нормальной тепемратуре (постоянное тепловое движение). То есть она совершает много разных движений и некоторые из них способствуют продуктивной транслокации. Что мешает тРНК встать на свои классические места? Много чего, но в первую очередь малая субъединица, которая держит их антикодоны плотно в районе своей шеи. Чтобы транслокация прошла нужно, чтобы шейный отдел малой субъединицы сдвинулся (на схеме вправо) так, чтобы тРНк оказались на уровне Р и Е сайтов (а они в А и Р). То есть она должна сдвинуться на другое место и отогнуть голову (отпустить антикодоны этих двух т РНК), и тогда они будут захвачены своими классическими сайтами Р и Е, ведь у них к ним высокое сродство. После транслокации рибосома вновь становится более компактной, замкнутой, вплоть до того момента, пока уходит деацилированная тРНК из Е участка. Этот процесс ухода сложно привязать к чему-то. Думало, что уходит в ответ на вход новой ААтРНК, но не подтвердилось. На работающей рибосоме три тРНК почти никогда не бывают одновременно, то есть уходит до прихода новой. И после ухода рибосома вновь расслабляется и малая субъединица вновь получает свободу двигаться вращательным образом относительно большой.
По поводу движения малой субъединицы. Субъединицы контачат более чем в 10 точках (называются бриджами в кристаллографии) и обозначаются циферками. Большая часть на самой длинной 44 спирали, но не только на ней. Трудно представить вращательные движения. Скорее всего, сначала разрыв контактов, может быть не всех (за счет некоторых спиралей движение может быть возможно). То есть движение размыкательно-винтовое. Есть некоторые данные, которые с помощью переноса энергии это показали.