Подтверждающая диагностика
Иммунный блотинг (ИБ)
ИБ - это метод, являющийся верификационным и позволяющим дать заключение об истинной позитивности, сомнительном результате или ложной серопозитивности. ИБ также относится к иммунохимическим методам, но, в отличие от ИФА, при постановке реакции выявляют не сумму антител, а спектр антител к белкам ВИЧ.
Принцип метода состоит в том, что в специализированных производственных условиях выращивают ВИЧ in vitro, вирусную массу многократно очищают от примесей и дезинтегрируют вирус. Затем фракционируют вирусные белки в полиакриламидном геле и переносят электрофорезом разделенные белки ВИЧ на иитроцеллюлозную мембрану, которую нарезают на полоски шириной 5 мм, именуемые стрипы. При проведении исследования стрипы с вирусными антигенами помещают в планшет, заливают исследуемой сывороткой, а полученные комплексы антиген - антитело проявляют с помощью иммунохимической реакции, аналогичный ИФА. Учет результатов визуальный: по наличию или отсутствию полос.
В сыворотке лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим белкам: оболочки (env) -gpl60, gp 120, gp41; ядра (gag) - pi7, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - рЗ 1, p51, рбб. У ВИЧ-2 детектируются антитела к env - gp 140, gpl 05, gp36; gag - pi 6, p25, p56; pol - p68.
Результаты, полученные в ИБ, интерпретируются как положительные (рис. 20, 21), сомнительные и отрицательные. Для сомнительного результата могут быть два вероятных объяснения. Во – первых, наличие в крови пациента антител, обладающих перекрестной реактивностью с одним из белков ВИЧ (обычно р24 и р55). Во – вторых, при ВИЧ – инфекции на самых ранних стадиях
.
Рисунок 20. Положительный иммунный блотинг ВИЧ-1 (из руководства для врачей под редакцией Н.А.Белякова и А.Г.Рахмановой ВИЧ-медицина, 2011 г.).
Рисунок 21. Полоски-стрипы из блота. Чтение результатов (полоска А - положительный контроль; полоска В - слабоположительный контроль; полоска С - отрицательный контроль)
Согласно рекомендациям ВОЗ положительными считаются сыворотки, в которых обнаружены антитела к двум белкам гена env в сочетании или без реакции с другими белками (gag, pol). При наличии взаимодействия с одним из белков оболочки в сочетании с другими белками реакция считается сомнительной и рекомендуется повторное тестирование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, то рекомендуется исследование в течение 6 месяцев (2 недели, 3 мес., 6 мес.). Если при повторных исследованиях в течение 6 месяцев не имеется прогрессии в отношении количества полос, инфекцию ВИЧ, как правило, можно исключить.
Отрицательный результат ИБ при наличии клинических и эпидемиологических подозрений на ВИЧ – инфекцию не отвергает возможность данного заболевания и требует повторного лабораторного исследования.
В случаях положительного результата ИФА и отрицательного или неопределенного результата в ИБ для установления факта инфицирования необходимо использовать дополнительные методы исследования.
Одним из таких методов является определение присутствия в исследуемом образце крови основного белка сердцевины ВИЧ р24 методом ИФА, концентрация которого высока в период «серологического окна» и в терминальной стадии заболевания.
Другим методом дополнительного исследования при неопределенных результатах является постановка ИБ с использованием антител к белкам ВИЧ – 2.
1.1.2. Молекулярно – биологические методы (определение концентрации ВИЧ и резистентности к антиретровирусным препаратам)
Методы ИФА, ИБ, несмотря на очевидную простоту, чувствительность, доступность, имеют существенные недостатки, связанные с наличием перекрестных реакций белков нормальных сывороток с антигенами ВИЧ, что приводит к ложнопозитивным результатам. Такие случаи требуют дифференциальной диагностики и прямого выявления нуклеиновых кислот в исследуемом материале с помощью реакции молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В молекулярной диагностике ВИЧ – инфекции можно выделить 4 основных направления:
- ДНК - диагностика ВИЧ;
- РНК – диагностика ВИЧ;
- определение профиля резистентности ВИЧ;
- ПЦР – диагностика оппортунистических инфекций.
ДНК – диагностика ВИЧ – инфекции основана на обнаружении провирусной ДНК в клетках крови.
Показаниями к тестированию пациента на ДНК ВИЧ служат: раннее выявление ВИЧ у детей, рожденных от ВИЧ – инфицированных матерей, выявление ВИЧ в период серологического окна. Тестирование применяется также в случае сомнительного результата ИБ.
РНК – диагностика ВИЧ – инфекции (определение вирусной нагрузки) используется для количественного измерения концентрации вируса в крови. Концентрация РНК ВИЧ измеряется в количестве копий РНК ВИЧ в миллилитре крови или в десятичных логарифмах (log 10) на миллилитр крови.
В настоящее время существует три основных метода определения вирусной нагрузки: полимеразно - цепная реакция (ПЦР), метод разветвленной ДНК, изотермальная амплификация (NASBA). В России на данный момент применяются тест – системы для определения вирусной нагрузки ВИЧ на основе первых двух методик.
Установлено пять классов вирусной нагрузки:
1) менее 500,
2) 501-3000,
3) 3001 - 10000,
4) 10000-30000,
5) более 30000 копий/ мл.
Вирусную нагрузку следует измерять на фоне стабильного клинического состояния не ранее чем через 4 недели после вакцинации или перенесенной инфекции.
Вирусную нагрузку следует определять каждые 3 – 4 месяца во время лечения, чтобы убедиться, что она сохраняется на уровне ниже 50 копий/мл. Постоянный уровень вирусной нагрузки более 50 копий/мл указывает на репликацию вируса и, следовательно, на возможность присутствия в его геноме мутаций резистентности.
Небольшие подъемы вирусной нагрузки от неопределяемого уровня до 50 – 200 копий/мл могут наблюдаться и без развития устойчивых штаммов вируса, но тем не менее, в случае таких «всплесков» следует убедиться в приверженности пациента режиму лечения. Единичные «всплески» допустимы, однако постоянный уровень вирусной нагрузки выше 50 копий/мл свидетельствует о вирусологической неудаче терапии.
Показания для проведения тестирования РНК ВИЧ:
- первичная диагностика ВИЧ – инфекции, если результат иммуноблота неопределенный;
- первичная оценка стадии выявленной ВИЧ – инфекции;
- перед началом антиретровирусной терапии;
- беременные ВИЧ – инфицированные женщины за 4 недели до предполагаемых родов;
- ВИЧ – инфицированные лица, состоящие на диспансерном учете (в том числе получающие ВААРТ), обследуются согласно стандартам.
Определение резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам
Существуют два метода определения устойчивости ВИЧ к препаратам – генотипический и фенотипический.
При генотипировании проводят анализ последовательности генома ВИЧ, выделенного от пациента, в сравнении с референсной последовательностью «дикого/чувствительного ко всем препаратам» вируса. Мутации ВИЧ определяют как отличия в аминокислотных последовательностях по сравнению с референсным штаммом. Полученный результат с помощью специальных компьютерных программ подвергают так называемому «виртуальному фенотипированию». Результат такогого анализа предоставляется клиницисту в виде трех вариантов чувствительности вируса к каждому препарату – «чувствительный», «резистентный», «возможно резистентный».
В большинстве зарубежных рекомендаций содержатся следующие показания для проведения теста на резистентность ВИЧ – инфицированным пациентам, получающим ВААРТ:
- не удалось снизить вирусную нагрузку на 0,5 – 0,7 lg копий/мл через четыре недели терапии;
- не удалось снизить вирусную нагрузку на 1 lg копий/мл через 8 недель терапии;
- вирусная нагрузка более 1000 копий/мл через 16 – 24 недель терапии;
- нарастание после первичного снижения вирусной нагрузки на фоне ВААРТ.
Методы исследования вируса на резистентность дают наиболее точные результаты в отношении препаратов, которые пациент принимал на момент тестирования или закончил принимать не более чем за 4 недели до проведения тестирования, поскольку популяция вируса дикого типа может восстановиться уже через 4 недели после отмены ВААРТ.