НУКЛЕОТИДНЫЙ СОСТАВ ДНК.

Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) - это линейные (или циклические), неразветвленные полидезоксирибонуклеотиды. Структурной единицей ДНК являются дезоксирибонуклеотиды, а именно дезоксирибонуклеозидмонофосфаты (ДНМФ).

ДНМФ - это соединения, состоящие из пуринового или пиримидинового азотистого основания, дезоксирибозы и одного остатка фосфорной кислоты.

В качестве пуриновых оснований в состав ДНМФ входит аденин и, гуанин, пиримидиновые основания представлены тимином и цитозином. Важной особенностью гидроксипроизводных пурина и пиримидина является возможность их таутомерных (лактим-лактамных) превращений. В составе ДНК все гидроксипроизводные азотистые основания присутствуют в форме лактамов (кето-форме).

Дезокрибонуклеозидмонофосфаты.

Дезоксиаденозинмонофосфат Дизоксигуанозинмонофосфат

дАМФ дГМФ

Дезоксицитидинмонофосфат Дезокситимидинмонофосфат

дЦМФ дТМФ

В составе ДНК, наряду с указанными ДНМФ, в небольших количествах встречаются ДНМФ с минорными (экзотическими) основаниями. Минорные азотистые основания - это метилированные, гидроксиметилированные или глюкозилированные основания, образующиеся в результате модификации главных оснований в составе полидезоксирибонуклеотида в ходе процессинга (созревания) ДНК. Примерами минорных азотистых оснований являются:

пуриновые основания пиримидиновые основания

N₆-метиладенин 5-митилцитозин

1(или 3, или7)-метилгуанин 5-гидроксиметилцитозин уранил

N₂-метил (или диметил)-гуанин гидроксиметилурацил

Для изучения нуклеотидного состава ДНК используют гидролиз ДНК с последующей хроматографией и качественным и количественным определением азотистых оснований. Наряду с классическими методами анализа нуклеотидный состав ДНК можно определить также по температуре плавления ДНК (содержание ГЦ-пар прямо пропорционально температуре плавления) и по плавучей плотности ДНК при ее ультрацентрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия (содержание ГЦ-пар прямо пропорционально плавучей плотности).

При анализе нуклеотидного состава ДНК разных видов организмов был установлен ряд закономерностей, характеризующих количественное соотношение азотистых оснований (правила Чаргаффа).

1. Молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина, а молярное содержание гуанина равно молярному содержанию цитозина.

А = Т, или А : Т = 1.

Г = Ц, или Г : Ц = 1.

2. Сумма пуриновых оснований равна сумме пиримидиновых оснований.

А + Г = Т + Ц, или (А+Г) : (Т+Ц) = 1.

пурины = пиримидины.

3. Нуклеотидный состав ДНК разных клеток многоклеточного организма одинаков.

4. Каждый биологический вид характеризуется постоянным специфическим нуклеотидным составом ДНК, что находит свое отражение в коэффициенте специфичности.

А + Т

К = -----------;

Г + Ц

В зависимости от преобладания АТ или ГЦ различают соответственно АТ- и ГЦ-типы ДНК. АТ-тип характерен, в частности, для хордовых и безпозвоночных животных, высших растений, дрожжей. У разных видов бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильновыраженного ГЦ-типа до АТ-типа. На основании коэффициента специфичности разработаны принципы геносистематики объектов растительного и животного мира.

3.3 ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ДНК.

Дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) представляют собой линейные

( или циклические) полидезоксирибонуклеотиды.

Первичная структура ДНК - это последовательность чередования остатков дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (ДНМФ) в полидезоксирибонуклеотидной цепи.

Первичная структура ДНК является ковалентной структурой, поскольку остатки ДНМФ в полидезоксирибонуклеотидной цепи соединены друг с другом 3', 5'-фосфодиэфирными связями.

Скелет (хребет, остов) полидезоксирибонуклеотида состоит из монотонно чередующихся остатков дезоксирибозы и фосфатных групп, присоединенных к остову на равных расстояниях друг от друга. Сахарофосфатный остов ДНК, обладая большим отрицательным зарядом, представляет собой сильно полярную часть молекулы, тогда как азотистые основания являются неполярными, гидрофобными компонентами.

Полидезоксирибонуклеотидная цепь обладает векторностью, она имеет направление от 5'-конца (начало цепи) к 3'-концу (конец цепи), т.е. 5'---->3'. 5'-конец (фосфатный конец) и 3'-конец (гидроксильный конец) - это концы, на которых от межнуклеотидной связи свободны соответственно 5'- и 3'-атомы дезоксирибозы. Векторность обусловлена направлением сборки полидезоксирибонуклеотидной цепи.

Коэффициент поликонденсации ДНК варьирует от 0,5 ^.10⁴ у вирусов до 10⁸ у ядерных ДНК высших эукариот. В соответствии с этим молекулярная масса ДНК также варьирует в широком диапазоне, достигая у высших эукариот нескольких десятков миллиардов дальтон. В то же время, количество кодируемых белков у прокариот и эукариот отличается не более чем на порядок. Это объясняется как сложной организацией генов, так и наличием повторяющихся участков ДНК у эукариот.

У прокариот ДНК представлена одной молекулой. По мере усложнения видов величина и число различных ДНК увеличивается. У эукариот число ДНК равно числу хромосом. Таким образом, в клетках человека содержится 46 различных ДНК.

Каждая ДНК обладает уникальной первичной структурой, причем их первичная структура во всех клетках многоклеточного организма, по-видимому, совершенно одинакова.

Нуклеотидная последовательность ДНК обозначается, начиная с 5'-конца, с использованием однобуквенных символов А, Г, Ц и Т - для нуклеозидов

( нуклеотидов) и ф - для фосфатной группы, например: фАфТфГфГфЦ или фАТГГЦ.

Сложность исследования первичной структуры ДНК обусловлена очень большой длиной полидезоксирибонуклеотидной цепи и наличием всего лишь четырех видов нуклеотидов. Для расшифровки первичной структуры ДНК ранее использовались косвенные методы :

по сблоченности пуриновых и пиримидиновых нуклеотидных звеньев выяснение числа и структуры отдельных фракций нуклеотидов (т.н. изоплитов);

по кинетике реассоциации ДНК (наличие повторяющихся последовательностей);

по распределению минорных оснований;

по обнаружению в ДНК и определению последовательности палиндромов.

В настоящее время широкое распространение получили прямые методы, которые используются в следующей последовательности:

расщепление различными рестриктазами с образованием перекрывающихся последовательностей;

электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в полиакриламидном геле в соответствии с числом содержащихся в них нуклеотидов;

расшифровка последовательности нуклеотидов в фрагментах;

установление порядка расположения нуклеотидных фрагментов по перекрывающимся участкам.

ОБРАЗОВАНИЕ ПОЛИДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ.

Рис. Фрагмент полидезоксирибонуклеоидной цепи