Запліднення in vitro

До середини 70-х років ХХ століття склалися усі передумови для практичної реалізації ідеї лікування безплідності методом ЗІВ: розуміння ендокринних механізмів регуляції репродуктивного циклу, процесів дозрівання яйцеклітини та імплантації ембріонів, механізмів впливу на них фармацевтичними препаратами, напрацювання методів дослідження сперми та її підготовки для штучної інсемінації, розробка обладнання, середовищ і умов культивування гамет та ембріонів in vitro.

Народження першої дитини, зачатої in vitro (25 липня 1978 року, Steptoe, Edwards), відкрило нову епоху в лікуванні безплідності – епоху принципово нових технологій допоміжної репродукції. В Україні першу успішну спробу застосування технологій ЗІВ було зроблено в Лабораторії кріобіології системи репродукції людини Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків). У 1991 році народилася перша в Україні дитина зачата за методом ЗІВ.

На сьогодні програма ЗІВ набула значного поширення в усьому світі. Частота настання вагітності при лікуванні безплідності методом ЗІВ у різних клініках досягає в середньому 20 – 35 % у розрахунку на одне перенесення ембріонів.

Показання до ЗІВ:

1) жіноча безплідність:

а) абсолютна трубна безплідність (відсутність маткових труб або їхня непрохідність);

б) безплідність , зумовлена ендометріозом (за відсутності ефекту від медикаментозної терапії);

в) ендокринна безплідність за відсутності ефекту від інших методів лікування;

г) безплідність нез’ясованого ґенезу за відсутності ефекту від ІСЧ (протягом 6 циклів);

д) безплідність, зумовлена цервікальним фактором, за умови відсутності ефекту від лікування методом ІСЧ (протягом 6 циклів);

е) безплідність, зумовлена відсутністю або функціональною неповноцінністю яєчників чи матки, у цьому разі програма ЗІВ буде включати використання донорських яйцеклітин, ембріонів або програму сурогатного материнства;

2) чоловіча безплідність (олігоастенотератоспермія І – ІІ ступеня за умови неможливості проведення або неефективності ІСЧ).

Першим етапом програми ЗІВ є контрольована суперовуляція (КСО), мета якої – запобігання атрезії більшості фолікулів і одержання кількох, здатних до запліднення яйцеклітин. У разі перенесення в порожнину матки кількох ембріонів імовірність імплантації вища, ніж при перенесенні одного ембріона.

Для КСО здебільшого використовують препарати рекомбінованого або високо очищеного ФСГ (гонал-Ф, пурегон,фостимон,менопур, Serono, Organon, AMSA, Ferring). На сьогодні «золотим стандартом» вважається використання препаратів ФСГ у комплексі з такими антагоністами гонадотропного рилізинг-гормону (ангнРГ), як диферелін, бусерин, Фарм-Синтез, Beafour Ipsen.

Дія цих препаратів аналогічна дії рилізинг-гормону гіпоталамуса. Зв’язування їх із рецепторами гіпофіза спричинює короткочасне підвищення секреції власного ФСГ (ефект спалаху, flare-up), після чого настає стійка десенситизація (нечутливість) гіпофіза внаслідок перенасичення рецепторів. Клінічно цей ефект проявляється у вигляді короткочасної оборотної медикаментозної кастрації. Переважно використовують аГнРГ (агоністи) завдяки їхній здатності запобігати передчасному підвищенню рівня ЛГ і зберігати базальний рівень ендогенного ЛГ зниженим, що забезпечує лікувальному циклу більшу керованість і прогнозованість. На сьогодні розроблено відносно нову групу анГнРГ – цетротид, оргалутран, Serono, Organon, які зумовлюють десенситизацію без початкового стимулювального ефекту. Додатково, залежно від показань і досвіду попередніх лікувальних циклів, призначають бромкриптин, кортизол, L-тироксин, мультивітамінні комплекси, ацетилсаліцилову кислоту тощо. У разі дефіциту власного ЛГ до протоколу КСО включають рекомбінований ЛГ (люверис, Serono).

Протокол стимуляції із застосуванням лише препаратів ФСГ та ХГ отримав назву «чистої» схеми КСО. З 2-го по 12-й день менструального циклу щоденно ФСГ 75 – 225 МО, на 13-й день ХГ. У процесі використання «чистої схеми нерідко доводиться переривати лікувальний цикл у програмі ЗІВ у зв’язку з передчасним ендогенним піком вмісту ЛГ, який спостерігається приблизно у третини пацієнток і призводить до лютеїнізації передовуляторних фолікулів та дегенерації яйцеклітини. Нині цю схему практично не використовують.

«Короткий» протокол КСО із застосуванням аГнРГ обирають переважно для запліднення пацієнток зі зниженим оваріальним резервом. Агоніст ГнРГ щоденно з1-го по 12-й день менструального циклу, ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по12-й день, на 13-й день ХГ.

«Тривалий» протокол КСО із застосуванням аГнРГ ефективний при заплідненні пацієнток з помірним і високим оваріальним резервом за винятком хворих з низькою реакцією яєчників на стимуляцію. Агоніст ГнРГ щоденно з 21-го дня менструального циклу і продовжують лікування щоденно по12-й день наступного менструального циклу , ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по12-й день цього циклу, ХГ на 13-й день. Не рекомендують застосовувати цей протокол при схильності до полікістозу яєчників у зв’язку з високим ризиком розвитку тяжкого синдрому гіперстимуляції яєчників.

Протоколи з використанням антагоністів ГнРГ мають певні переваги перед застосуванням аГнРГ (протокол КСО з використанням депо-форми анГнРГ – ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по 12-й день менструального циклу, анГнРГ одноразово 3 мг на 7-й день, ХГ на 13-й день; протокол КСО зі щоденним уведенням анГнРГ – ФСГ щоденно 75 – 225 МО з 2-го по 12-й день циклу, антагоніст ГнРГ 0,25 мг щоденно з 6-го по 13-й день, ХГ на 13-й день.) : сумарна доза ФСГ на один лікувальний цикл знижується на 30 % (зниження вартості лікування), відсутній ефект початкової стимуляції (спалаху), що запобігає утворенню кіст яєчників, нижча частота розвитку синдрому гіперстимуляції яєчників (особливо актуально для пацієнток із синдромом полікістозних яєчників), зменшення тривалості лікувального циклу (у 2 – 2,5 разу порівняно з «тривалою» схемою з аГнРГ), у разі ненастання вагітності гормональний гомеостаз пацієнтки відновлюється значно швидше, ніж при використанні аГнРГ.

Слід зазначити, що у процесі стимуляції суперовуляції слід постійно спостерігати за змінами в яєчниках пацієнтки та її ендокринному статусі, оскільки сама по собі КСОє досить серйозним втручанням у нейроендокринні процеси, що відбуваються в організмі жінки. Крім того, організм кожної жінки по-різному реагує на стимуляцію. Зручним з погляду практики параметром, на підставі якого можна заздалегідь оцінити ефект стимуляції яєчників, та ймовірність настання вагітності, є визначення базального рівня ФСГ і ЛГ на 2 – 3-й день менструального циклу (поза стимуляцією).

Ультразвукове дослідження органів малого таза є одним з найважливіших методів обстеження у процесі клінічного спостереження за пацієнткою при КСО. Для об’єктивної оцінки стану пацієнтки також проводять гормональний моніторинг (естрадіол у першу фазу лікування, естрадіол та прогестерон – у другу фазу). У нормі кількість зрілих фолікулів має корелювати з рівнем естрадіолу. З іншого боку, значення цього показника перед пункцією понад 4000 пг/мл свідчить про небезпеку розвитку синдрому гіперстимуляції яєчників тяжкого ступеня. У цьому разі потрібно утриматися від уведення овуляторної дози ХГ або взагалі відмінити його, а також відмовитись від підтримувальної терапії лютеїнової фази людським ХГ.

На завершальному етапі стимуляції суперовуляції призначають ХГ в овуляторній дозі (прегніл, Органон, овітрел,Сероно), імітуючи природний пік рівня ЛГ в організмі жінки. Критерії готовності пацієнтки до призначення овуляторної дози ХГ:

1) за даними УЗ-моніторингу: діаметр фолікула-лідера – 17 – 18 мм; наявність додаткових двох фолікулів або більше діаметром 14 мм; товщина ендометрія – 8 мм;

2) за даними гормонального моніторингу: рівень естрадіолу в плазмі крові – 100 – 150 пг/мл на кожний великий фолікул.

За наявності вищевказаних ознак пацієнтці ввводять тригерну дозу ХГ (5000 – 10 000 ОД).

Через 34 – 36 год після введення ХГ під УЗ-контролем виконують пункцію фолікулів та аспірацію яйцеклітин. Пункцію здійснюють в асептичних умовах під короткочасним наркозом переважно трансвагінальним доступом. Під контролем трансвагінального УЗ-датчика проколюють стінку піхви, потім яєчника, аспірують вміст фолікулів у стерильні теплі пробірки та передають ембріологам.

Безпосередньо після цього яйцеклітини переносять у чисте середовище для культивування, оцінюють ступінь їх зрілості і морфологію. На підставі результатів оцінювання ооцити культивують від 4 до 6 год. Потім проводять інсемінацію зрозрахунку 50 000 – 100 000 сперміїв на одну яйцеклітину. Для підготовки сперміїв використовують методику “swim-up”, або метод центрифугування в градієнтах щильності (SupraSperm System, Medicult; IsoLate, Irvine Scientific). Яйцеклітини й ембріони культивують в умовах інкубатора за температури 37 ^оС, вмісту СО₂ 5 % і вологості повітря 80 – 95 %. Такі умови необхідні для функціонування буферних систем культуральних середовищ і нормального розвитку ембріонів. Усі середовища та лабораторний посуд мають відповідати стандартам ембріологічної лабораторії.

Методика ІЦІС (інтрацитоплазматична ін’єкція сперміїв)

При тяжких порушеннях сперматогенезу використовують методику ІЦІС, для застосування якої достатньо поодиноких сперміїв в еякуляті. Навіть за відсутності сперміїв в еякуляті їх можна одержати шляхом аспірації безпосередньо із проток над’яєчка (MESA – Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration). У разі рубцювання тканини над’яєчка або відсутності сперміїв у матеріалі, отриманому методом MESA, застосовують техніку відкритої біопсії яєчка з екстракцією сперміїв із тканини яєчка (TESE – Testicular Sperm Extraction) для проведення ІЦІС. Для ІЦІС беруть яйцеклітини, очищені за допомогою ферменту гіалуронідази від клітин cumulus. Спермії поміщають у в’язкий розчин (10 % розчин полівінілпіролідону) для обмеження їх рухливості, після чого їх селекціонують. Відбирають лише спермії, які відповідають морфологічним критеріям норми. Наступний етап: голкою для ін’єкції травмують клітинну мембрану в ділянці хвоста спермія, що призводить до його іммобілізації. Спермій затягують в голку. Фіксують яйцеклітину спеціальною голкою з тупим кінцем так, щоб полярне тіло опинилося на 6 чи на 12 годинах. Після цього повільно вводять спермій у цитоплазму яйцеклітини. Яйцеклітину визволяють та переносять в інкубатор.

Через 16 год після інсемінації або ІЦІС потрібно проконтролювати наявність про нуклеусів (чоловічого та жіночого) – презиготи, у якій виявляють два пренуклеуса, і перенести їх у чисте середовище. У середньому через 48 год після запліднення оцінюють морфологічні властивості і темпи дроблення ембріонів.

На цьому етапі часткове розсікання оболонки ембріона механічним, хімічним способами, за допомогою лазера (Assisted Hatching) може підвищити ймовірність настання вагітності. Окрім цього, виконують передімплантаційне генетичне дослідження методом біопсії еластомерів та/або полярних тіл з метою діагностики ізольованих генних і хромосомних дефектів, а також визначення статі ембріона для запобігання розвитку пов’язаних зі статтю спадкових захворювань.

І дотепер серед дослідників немає єдиної думки щодо кількості ембріонів, яку варто переносити в порожнину матки, оскільки перенесення більшої кількості ембріонів підвищує ризик настання багатоплідної вагітності. Вважають, що в порожнину матки варто переносити не більше трьох ембріонів, а у разі високої ймовірності настання вагітності – не більше двох.

Ембріони готові для перенесення на стадії 4 – 8 бластомерів. Іноді їх культивують до стадії бластоцисти.

Для перенесення ембріонів використовують спеціалізовані катетери. Процедуру виконують в асептичних умовах. Катетер слід уводити на глибину, яка відповідає 2/3 довжини порожнини матки (За даними УЗД) таким чином, щоб не травмувати ендометрій.

У разі збереження анатомічної та функціональної повноцінності маткових труб застосовують альтернативний метод – перенесення гамет, зигот або ембріонів у маткові труби (GIFT – Gamete Intrafallopian Transfer, ZIFT – Zygote Intrafallopian Transfer, TET – Transtubal Embryo Transfer) лапароскопічно або трансвагінальним доступом. Останнім часом ці методи практично не використовують у зв’язку з високою частотою настання позаматкової вагітності.

Наступним етапом є підтримка лютеїнової фази, яку слід розпочинати з моменту пункції та продовжувати до тесту на вагітність. Вона включає призначення препаратів прогестеронподібної дії, переважно препарати ХГ, урожестан у дозі 600 – 800 мг на добу інтравагінально або дуфастон у дозі 80 – 90 мг на добу. Можливе використання інтравагінальних препаратів у формі гелю (кринон гель 8 %). Ембріони, що залишилися, кріоконсервують у розчині кріопротекторів за допомогою відповідних програмних заморожувачів. Термін зберігання кріоконсервованих ембріонів у рідкому азоті необмежений.Через 11 – 15 днів після перенесення ембріона у крові пацієнтки визначають рівень ХГ. У разі одержання позитивного результату (титр перевищує 20 МО) терапію продовжують. Перше УЗД проводять через 3 – 4 тиж. після перенесення ембріона для візуалізації його структур у порожнині матки. За умови настання вагітності терапію продовжують до терміну 7 – 8 тиж. вагітності.

В останні роки лікувальні програми з використанням донорських яйцеклітин та ембріонів зробили можливим настання вагітності навіть у подружніх пар з абсолютною безплідністю, зумовленою різними формами дисгенезії гонад, синдромом резистентних яєчників, відсутністю гонад унаслідок хірургічної, радіаційної або медикаментозної кастрації.

За неможливості виносити вагітність (відсутність матки або наявність протипоказань для виношування вагітності) рекомендують застосувати програму сурогатного материнства.

Щодо донорства яйцеклітин, то послідовність дій схематично можна показати таким чином: обстеження подружньої пари та жінки-донора – КСО донора – отримання яйцеклітин донора – запліднення яйцеклітин донора спермою чоловіка реципієнтки – перенесення ембріонів до порожнини матки реципієнтки.

Щодо сурогатного материнства: обстеження подружньої пари та сурогатної матері – КСО пацієнтки – отримання яйцеклітин пацієнтки – запліднення яйцеклітин пацієнтки спермою чоловіка – перенесення ембріонів до порожнини матки добровільної сурогатної матері.

У медичному аспекті ці програми принципово не відрізняються від ЗІВ. Однак недосконалість юридичної бази обмежує доступність цих програм. Слід зазначити, що в Україні жінка-донор або сурогатна мати не отримує гонорар за свої послуги, а лише право на грошову компенсацію.

Ускладнення запліднення методом ЗІВ. Синдром гіперстимуляціїяєчників – ятрогенний стан, в основі розвитку якого лежить нефізіологічна відповідь яєчників на екзогенне введення гонадотропінів. Порушення бар’єрної функції судинної стінки яєчника призводить до виходу рідини в черевну порожнину, унаслідок чого збільшуються втрати білка, наростають явища гіповолемії та гемоконцентрації, підвищується ризик тромбоемболічних ускладнень, порушується ниркова перфузія, розвивається олігурія та преренальна форма гострої недостатності, формується асцит та випіт у плевральній порожнині. Синдром гіперстимуляції яєчників легкого ступеня лікування не потребує, середнього, а особливо тяжкого ступеня (діаметр яєчників – понад 12 см, рівень естрадіолу перевищує 6000 пл/мл, асцит, випіт у плевральну порожнину, гематокритне число – понад або дорівнює 45 %, олігурія, тромбоемболія) потребує інтенсивного лікування в стаціонарі. Лікування включає інфузійну терапію з переважним використанням колоїдних розчинів порівняно з кристалоїдами. Показані патогенетичне застосування препаратів гідроксиетилкрохмалю 6 % та 10 %, свіжозамороженої плазми, розчину альбуміну 10 % та 25 %, нестероїдні протизапальні, антигістамінні препарати, інгібітори ангіотензинконвертуючого ферменту. При напруженому асциті можливе застосування лікувальних парацентезів з евакуацією не більше ніж 500 – 700 мл рідини за одну маніпуляцію на тлі адекватної інфузійної терапії.

Багатоплідна вагітність є частим ускладненням запліднення методом ЗІВ, пов’язаним із перенесенням великої кількості ембріонів у порожнину матки. Її чостота може досягати 20 % випадків порівняно з 1 – 2 % у загальній популяції. Стратегія обмеження кількості ембріонів до 1 – 2 ще не знайшла широкої підтримки у зв’язку із суттєвим зниженням частоти настання вагітності за програмою ЗІВ. Серед шляхів вирішення цієї проблеми – розробка способів селекції найжиттєздатніших ембріонів і перенесення ембріонів на стадії бластоцисти.

У разі присутності в порожнині матки трьох та більше життєздатних ембріонів слід проводити процедуру їх редукції в терміні 5 – 11 тиж. вагітності трансвагінальним, трансцервікальним або трансабдомінальним доступами під короткочасним наркозом. Під УЗ-контролем пункційною голкою проколюють грудну клітку вибраного ембріона з метою припинити його серцеву діяльність. Зазвичай залишають два життєздатних ембріона в порожнині матки. Після такого втручання значно зростає частота мимовільних абортів.

Позаматкова вагітність можлива за наявності у пацієнтки маткових труб або їхніх фрагментів (велика культя). Найвірогідніша причина розвитку трубної вагітності після перенесення ембріонів у порожнину матки – її скорочення в момент перенесення ембріонів, що призводить до їх потрапляння в маткові труби. Тактика лікування не відрізняються від стандартної тактики при ектопічній вагітності.