Методические рекомендации по подготовке к занятию

Тема 11 Количественное определение пигментов

Методические рекомендации по подготовке к занятию

Межклетники листа обычно заполнены воздухом, благо­даря чему при рассматривании на свет лист кажется матовом. Если произойдет инфильтрация, т. е. заполнение меж­клетников какой-либо жидкостью, то соответствующие уча­стки листа становятся прозрачными.

Определение состояния устьиц методом инфильтрации основано на способности жидкостей, смачивающих клеточ­ные стенки, проникать в силу капиллярности через откры­тые устьичные щели в ближайшие межклетники, вытесняя По них воздух, в чем легко убедиться по появлению на листе прозрачных пятен. Жидкости проникают в устьичные щели В-зависимости от их ширины: петролейный эфир — через слабо открытые устьица, ксилол — через средне открытые, а эти­ловый спирт — только через широко открытые. Данный метод очень прост и вполне применим даже в полевых ус­ловиях.

Ход работы. На нижнюю поверхность листа нанести отдельно маленькие капли петролейного эфира, ксилола и эти­лового спирта. Держать лист в горизонтальном положении до полного исчезновения капель, которые могут либо испа­риться, либо проникнуть внутрь листа, и рассмотреть лист на свет.

Исследовать листья, выдержанные в разных условиях (свежье и подвядшие, освещенные и затемненные и т. п.). Каждый раз исследовать 2—3 листа.

Результаты записать в таблицу, отмечая проникновение жидкости знаком «+», а отсутствие проникновения зна­ком «—»:

Сделать выводы о влиянии внешних условий на устьичные движении.

Литература 6, с 51-52

Контрольные вопросы:

1 На чем основан метод инфильтрации для определение состояния устьиц?

Цель:

- ознакомить с устройством ФЭК- 56М, СФ-26. Ознакомить с методом определения концентрации хлорофилла

План:

1Определение концентрации хлорофилла на фотоэлектроколлориметре ФЭК – 56М

2 Определение концентрации хлорофилла и каротиноидов на спектрофотометре СФ-26

1 Для получения ацетоновой вытяжки навеску (0,1 -0,15 г) листьев определенного яруса помещают в фарфоровую ступку, добавляют немного диоксида кальция, промытого квар­цевого песка и растирают с 2—3 мл 85%-ного раствора ацетона. К растертой массе добавляют 4—5 мл ацетона и снова растирают несколь­ко минут. После отстаивания раствора нижнюю сторону носика ступки слегка смазывают вазелином, экстракт осторожно сливают по палочке в воронку со стеклянным фильтром № 2 и отсасывают насосом.

Перед перенесением вытяжки воронку вставляют при помощи каучуковой пробки в колбу Бунзена (или градуированную вакуум­ную пробирку), соединенную с насосом. Экстракцию небольшими порциями чистого растворителя повторяют до тех пор, пока пигмен­ты не будут извлечены полностью. Затем фильтрат переливают че­рез сухую стеклянную воронку в мерную колбочку на 25 мл. Колбу Бунзена дважды ополаскивают небольшой порцией ацетона, каждый раз сливая жидкость в мерную колбочку. Далее содержимое колбоч­ки доводят растворителем до метки, закрывают каучуковой пробкой, тщательно взбалтывают и используют для определения концентра­ции пигментов. Анализ пигментов выполняют при комнатной температуре на рассеянном свету, так как при сильном освещении может произойти фотоокисление хлорофилла. Хранят вытяжку в темном холодном месте.

Для установления концентрации окрашенных растворов на фотоэлектроколориметре измеряют разность силы электрических токов, возникающих между двумя фотоэлементами в результате неодинаковой интенсивности световых потоков, прошедших через растворитель и раствор. Общий вид фотоэлектроколориметра представлен на рисунке . Прибор снабжен кювет с различными расстояниями между рабочими гранями. Это позволяет выбрать для раствора кювету такой рабочей длины, которая позволяла бы выполнять измерение на участке шкалы, дающем наиболее надежные результаты. Так, для хлорофилла этот интервал расположен между 0,1 и 0,4 делениями красной шкалы левого барабана.

Включают прибор в сеть и тумблер стабилизатора ставят в поло­жение «Включ.». Прибору дают прогреться 30 мин. Затем при закрытой шторке вращением отсчетных барабанов 6 совмещают риску с «0» делением шкалы, после чего при помощи рукоятки 9 устанав­ливают стрелку гальванометра на «0». Далее открывают крышку прибора и в левый кюветодержатель ставят кювету с растворителем 0 мм), а в правый — соответственно кюветы с растворителем и иссле­дуемым раствором. В кюветодержателях 4 все кюветы должны быть установлены на одинаковом расстоянии от входного отверстия и обращены к источнику света одной и той же гранью. Рабочие грани кювет следует протереть фильтровальной бумагой. Чтобы не загрязнить их, нельзя касаться этих граней ниже уровня жидкости.

Вращением барабана 8 установите красный светофильтр. В правом кюветодержателе в световой поток поместите кювету с раствором. Установите «0» на правом барабане.

Рис. 5 Общий вид фотоэлектроколориметра ФЭК-56М:

1—корпус прибора; 2—крышка; 3—рукоятка шторки; 4–кюветодер-жатели; 5— окна отсчетных барабанов со шкалой; 6—отсчетные бара­баны; 7—гальвано- метр; 8—барабан переключателя светофильтров; 9—рукоятка установки стрелки гальванометра на «О»; 10— рукоятка чувствительности; 11— барабан правого кюветодержателя

Вращением левого барабана установите стрелку гальванометра на «0». Затем поворотом барабана 11 в правом световом пучке замените кювету с раствором на кювету с растворителем. Вращением правого отсчетного барабана 11 возвратите стрелку гальванометра в нулевое положение. Отсчет берут по красной шкале правого барабана.

Показания шкалы барабана переводят в величины концентрации, пользуя калибровочный график. Для этого готовят серию стандартных растворов хлорофилла возрастающей концентрации и находят оптическую плотность каждого из них. Затем строят график. На осиоткладывают значения концентрации, а на оси ординат — сответствующие им значения оптической плотности. Точки пересе­ления соединяют и получают калибровочный график.

Стандартные растворы готовят в мерных колбочках на 25 мл; концентрацию исходного раствора хлорофилла обычно определяют на спектрофотометре. В качестве стандартного можно использовать так­же раствор Гетри. Кюветы должны быть той же рабочей длины, что и при определении оптической плотности исследуемого раствора.

Для того чтобы вычислить концентрацию хлорофилла, на оси орди­нат находят установленную величину оптической плотности и от нее проводят горизонтальную прямую до пересечения с кривой графика. Из точки пересечения опускают перпендикуляр на абсциссу и опреде­ляют концентрацию хлорофилла, % массы сырых листьев:

100- В

где В — количество хлорофилла в вытяжке, мг; А — масса сырых листьев, взятых для анализа, мг; 100 — коэффициент для выражения в процентах.

2 Спектрофотометрический анализ — наиболее точный количественный метод определения содержания пигментов листа. Как и на фотоэлектроколориметре, концентрацию пигментов на спектрофотометре определяют по оптической плотности. Однако в отличие от фотоэлектроколориметра спектрофотометр позволяет выполнять анализ смесей веществ с близкими максимумами 01цения> что достигается за счет использования монохроматора.

Вследствие этого удается установить содержание хлорофиллов и каротиноидов в вытяжке без предварительного разделения. Плотность 16 15 14 13 12 11

Рис. 6 Спектрофотометр СФ-26:

1— шкала монохроматора; 2 — рукоятка переключения источника излучения; 3 — кюветное отделение; 4— рукоятка переключения фотоэлементов; 5— рукоятка установ­ки чувствительности; 6— рукоятка установки стрелки измерительного прибора на нуль; 7— рукоятка шторки; 8— рукоятка перемещения каретки с кюветами; 9— рукоятка регулирования ширины щели; 10— шкала измерительного прибора; 11 — рукоятка отсчета для выбора шкалы измерений (имеет четыре положения); 12-рукоятка ком­пенсации; 13 — рукоятка установки длин волн; 14 — сигнальная лампа включения лампы накаливания «Н»; 15— сигнальная лампа включения дейтериевой лампы «Д»; 16— тумблер включения прибора в сеть и сигнальная лампа «Сеть»

При определении оптической плотности хлорофиллов и каротиноидов в вытяжке переключатель ламп (фотоэлемент и источник излучения) устанавливают в рабочее положение. При определении оптической плотности хлорофиллов рукоятку переключателя фото­элемента переводят в положение «К». После этого закрывают фото­элемент, поставив рукоятку шторки в положение «ЗАКР.», а рукоят­кой регулировки ширины щели 9 устанавливают ширину щели при­мерно 0,1мм.

Затем тумблером включают прибор в сеть. Если загорятся сиг­нальные лампы «СЕТ.» и «Н», можно выполнять последующие операции, но предварительно прибор должен прогреться в течение 3°-6О мин. После этого рукоятку компен- сации ставят на «О», рукоятку отсчета в положение «1» и рукоятку чувствительности в положение «1». Медленно вращая рукоятку, устанавливают нужную длину волны (для хлорофилла а — 663 нм, хлорофилла b — 644 нм). Затем кюветы с растворителем и исследуемым раствором (10 мм) помещают в кюветодержатель и закрывают кюветное отделение. При закрытом фотоэлементе при помощи рукоятки установки добиваются нулевого положения стрелки измерительного прибора(по верхней шкале), после чего рукояткой открывают фотоэлемент(при этом на пути светового потока должна стоять кювета с растворителем) и, регулируя ширину щели рукояткой, ставят стрелку На «О» нижней красной шкалы. Затем кювету с исследуемым раствором, переводят в рабочее положение (рукоятка S) и измеряют оптическую плотность (экстинкцию) по шкале Д. Результаты записывают по форме . Закрывают фотоэлемент и устанавливают длину волны для другого хлорофилла, дальше в той же последовательности определяют экстинкцию. При определении оптической плотности каротиноидов предварительно переводят рукоятку переключения фотоэлементов 4 в положение «Ф» и устанавливают длину волны 452,5 нм. Концентрацию пигментов рассчитывают по Реббелену. Опреде­лив концентрацию пигмента, находят его содержание в опытном материале по той же формуле, что и в предыдущей работе. Содержание хлорофилла в листьях растении составляет в среднем около 0,3% сырой массы (0,1-0,7% ). При расчете на 1 дм 2 листовой поверхности количество хлорофилла варьирует в пределах 0,7-0,8 мг. Каратиноидов в листьях примерно в 3-8 раз меньше, чем хлорофилла.

Литература:6, с.6-10

Контрольные вопросы:

1Какова роль хлорофилла в процессе фотосинтеза?

2Какова роль каротиноидов в процессе фотосинтеза?

3Кто впервые высказал идею о существовании в хлоропластах двух фотосистем?