Вакцины

Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные (инактивированные в результате мутации) патогенные микроорганизмы (бактерии или вирусы). Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцины количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших предосторожностей; аттенуированные штаммы часто ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполной; срок годности вакцины зависит от условий ее хранения.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом разные подходы.

1. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, но иммунологически активные штаммы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными.

2. Клонированные гены, контролирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину.

3. Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в экспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет получать субъединичные и пептидные вакцины (соответственно, если используются полноразмерные гены или фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант).

Аттенуированные противохолерные вакцины.

Возбудителем холеры является холерный вибрион Vibrio cholerae. Бактерия размножается в тонком кишечнике и выделяет в большом количестве энтеротоксин, который ответственен за патогенный эффект. Энтеротоксин – гексамерный белок, состоящий из одной А и пяти Б субъединиц. Субъединица А имеет два функциональных домена: А1, обладающий токсической активностью и А2, отвечающий за связывание в доменами Б. Создали штамм Vibrio cholerae, из генома которого была делетирована часть кодирующей А1-пептид нуклеотидной последовательности. Этот штамм не синтезирует энтеротоксин, а потому не является патогенным и подходит для создания вакцины.

Ход работы. В ген на бактериальной хромосоме, кодирующий пептид А1 вставили ген устойчивости к тетрациклину. Ген А1 перестал работать, но патогенность часто восстанавливалась из-за спонтанного выбрасывания вставленного гена устойчивости к тетрациклину.

Выделили ген А1, вставили в плазмиду, обработали плазмиду рестриктазами ClaI и XbaI, разрезающими только последовательность А1. Чтобы замкнуть плазмиду в кольцо, к ClaI сайту пришили XbaI линкер и обработали плазмиду рестриктазой XbaI. С помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединили XbaI-сайты плазмиды. В результате из середины А1-последовательности оказался удален участок ДНК. С помощью конъюгации перенесли эту плазмиду в штамм Vibrio cholerae, несущий ген устойчивости к тетрациклину в локусе, кодирующем А1 пептид. В результате рекомбинации между А1-фрагментами хросомной и плазмидной ДНК перенесли делетированный ген А1 в бактериальную хромосому. Был получен стабильный непатогенный штамм холеры.

Другой способ создания аттенуированных вакцин состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за синтез жизненно важных белков. При этом лучше делетировать по крайней мере две такие жизненно важные области, поскольку вероятность их одновременного восстановления ничтожно мала. Штаммы с двойной делецией будут обладать ограниченной жизнеспособностью, но обеспечат иммунный ответ. Чтобы получить аттенуированные штаммы Salmonella, вносили делеции в гены aro, кодирующие ферменты синтеза ароматических соединений, и в гены pur, кодирующие ферменты метаболизма пуринов. Такие штаммы с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 106 раз меньшей вирулентностью. На их основе уже созданы эффективные вакцины для овец, крупного рогатого скота, цыплят и человека.

Противогриппозная вакцина.

Антигенные детерминанты вируса гриппа включают в геном кишечной палочки. Такая вакцина безопасна, так как кишечная палочка – естественный обитатель организма человека и животных. Введенный ген обеспечивает синтез антигенов гриппа, благодаря чему вырабатывается иммунитет.

Субъединичные вакцины.

Для выработки антител в организме-хозяине достаточно части патогенного штамма, вызывающей выработку антител. Так для выработки антител к вирусной инфекции достаточно очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки).

Вирус герпеса HSV вызывает тяжелые поражения глаз, энцефалит, урогенитальные инфекции. Кроме того он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с риском развития рака. Для защиты от вируса герпеса была разработана субъединичная вакцина. Иммуногенным компонентом вируса герпеса является гликопротеин оболочки (gD). Ген gD был изолирован и клонирован в экспрессирующем векторе в клетках млекопитающих. Полноразмерный ген gD кодирует белок, в норме связывающийся с мембраной клетки млекопитающего. Такой белок труднее очистить, чем растворимый, поэтому ген gD модифицировали, удалив ту его часть, которая ответственна за связывание с мембраной. Затем модифицированным геном трансформировали клетки китайского хомячка, которые приобрели способность синтезировать и секретировать белок в окружающую среду. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gD, обеспечивали иммунитет против герпеса.

Пептидные вакцины.

Эффективаной вакциной могут служить небольшие пептиды, располагающиеся на поверхности клетки и обладающие иммуногенными свойствами. Основным антигеном вируса ящура является вирусный капсидный белок 1 VP1. Геном вируса ящура представляет собой одноцепочечную РНК. Ее выделили и синтезировали по ней полноразмерную двухцепочечную кДНК. Затем кДНК разрезали рестриктазами и клонировали фрагменты в кишечной палочке. Фрагмент, кодирующий белок VP1 выявили иммунологическим методом. Используя ДНК гена VP1, синтезировали короткие пептиды – части белка VP1. Каждый из пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 141-160, 151-160, 200-213, сшили по отдельности с инертным белком-переносчиком, чтобы предотвратить их разрушение, и ввели морским свинкам. Синтез антител в количестве, достаточном для защиты животного от ящура, наблюдался только при введении пептида 141-160. Введение целого VP1 или других пептидов индуцировало синтез антител в меньших количествах.

Векторные вакцины.

В качестве эффективной живой противооспенной вакцины широко используют вирус коровьей оспы ВКО). Геном этого вируса полностью секвенирован; он представляет собой двухцепочечную ДНК длиной 187 тыс.п.н., кодирующую примерно 200 разных белков. ДНК ВКО реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток, а не в ядре, благодаря наличию у вируса генов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы и ферментов модификации РНК. Поэтому ВКО экспрессируется независимо от регуляторных и ферментных систем хозяина. Если в геном этого вируса вставить чужеродный ген под контролем промотора ВКО, он тоже будет экспрессироваться.

ВКО имеет широкий спектр хозяев, может храниться в лиофилизированном виде и не является онкогенным. Поэтому его можно использовать для создания векторных вакцин. С их помощью осуществляется доставка и экспрессия в организме хозяина клонированных генов, кодирующих антигенные белки, которые вызывают выработку защитных антител.

Геном ВКО имеет большие размеры, что позволяет встраивать в него большие гены. Нужные гены можно вводить в геном ВКО с помощью гомологичной рекомбинации.В плазмиду, содержащую ген тимидинкиназы (обеспечивает включение тимидина в ДНК) из ВКО, встраивают специфичный антиген под промотором ВКО. Этой плазмидой трансформируют культуру клеток животных, дефектных по тимидинкиназе. Одновременно эту культуру заражают вирусом ВКО дикого типа, имеющим функциональную тимидинкиназу. В результате рекомбинации между нуклеотидными последовательностями на флангах промотора и вводимого гена с геном тимидинкиназы из генома ВКО, происходит встраивание плазмидного гена в вирусную ДНК. Частота таких рекомбинаций невысока, однако популяцию клеток, содержащих рекомбинантный ВКО, можно обогатить, используя селективную среду с бромдезоксиуридином. Этот токсичный аналог тимидина в отсутствии тимидинкиназы не включается в синтезируемую ДНК и не оказывает токсического действия. Дефектные по тимидинкиназе клетки-хозяева, которые содержат обычный ВКО, в присутствии бромдезоксиуридина погибают, а клетки, несущие рекомбинантный ВКО с разрывом в гене тимидинкиназы, выживают. В них нарабатывается вирус, который можно выделить и использовать для прививок.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

В геном ВКО уже удалось встроить и экспрессировать антигены бешенства, герпеса, гепатита В, гриппа, стоматита. Векторная вакцина потив бешенства успешно апробирована на лисах – главных переносчиках этой болезни.