Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем.

Стабильность сохранения введенного гена выше, если он интегрирован не в плазмиду, а в бактериальную хромосому. В плазмиду вставляют кроме целевого гена участок, гомологичный какому-нибудь сайту хромосомной ДНК. Нужно выбирать некодирующий сайт, чтобы не нарушить работу генома бактерии. Плазмиду вводят в клетку кишечной палочки и за счет кроссинговера в бактериальную хромосому встраивается целевой ген или вся плазмида.

К синтезируемым в бактериальных клетках белкам можно аналогичным образом пришить сигнальные пептиды, направляющие продукт в определенные части клетки, например, в поверхностные структуры. Это препятствует нарушениям метаболизма бактериальной клетки при избытке чужеродного белка и облегчает последующее выделение белков.

Химерные белки используют не только для стабилизации белков, но и для упрощения процедуры их очистки. Например, для удобства выделения в чистом виде интерлейкина к нему (на уровне ДНК) присоединяют пептид, узнаваемый определенными антителами. Антитела фиксируют на поверхности хроматографической колонки. При пропускании смеси выделенных из клетки кишечной палочки белков интерлейкин с пришитым пептидом взаимодействует с антителами и остается на колонке. Остальные белки проходят не задерживаясь. Потом интерлейкин элюируют с колонки в чистом виде.

Для эффективной работы введенного гена важна его активная трансляция. Она зависит от свойств имеющегося в транскрибируемой РНК сигнала инициации трансляции, называемого сайтом связывания рибосомы. Сайт связывания рибосомы это последовательность из 6-8 нуклеотидов (например,UAAGGAGG), спаривающаяся с комплементарной последовательностью (в данном случае AUUCCUCC) рибосомной РНК малой субъединицы рибосомы. Чем прочнее связывание между мРНК и рРНК, тем выше эффективность трансляции. Поэтому большинство экспрессирующих векторов E.coli конструируют таким образом, чтобы ьРНК клонированного гена обязательно содержала сильный сайт связывания рибосомы.

Обычно время полужизни белков составляет от нескольких минут до нескольких часов. Такая вариабельность обусловлена различиями в числе дисульфидных связей в белковых молекулах и наличием или отсутствием на N-конце определенных аминокислот. Например, если к N-концу β-галактозидазы присоединять разные аминокислоты, то время жизни модифицированного белка может варьировать от нескольких минут до 20 часов.

Чтобы предотвратить разрушение вновь синтезированных чужеродных белков в бактериальной клетке этот белок присоединяют в белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название «химерный белок», продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления ферментами хозяйской клетки. Слияние белков программируется на уровне ДНК сшиванием кодирующих участков соответствующих генов. Векторная система слияния предусматривает включение гена мишени в кодирующий участок клонированного гена хозяина.

Химерный белок может использоваться целиком, но чаще от бактериальной части нужно избавляться. Один из способов – включение между геном бактерии и целевым геном короткой последовательности, кодирующей маленький пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такой связующей последовательностью может служить, например, пептид изолейцин – глутамин – глицин – аргинин. После синтеза и выделения химерного белка его обрабатывают специфической протеазой фактора свертывания крови, который разрывает пептидные связи на С-конце именно данной последовательности аминокислот.

Для активной работы белки часто должны претерпеть ряд посттрансляционных изменений: образование дисульфидных связей, протеолитическое расщепление предшественника, гликозилирование, модификация аминокислот в составе белка. Ферментативный аппарат бактерий не может произвести эти модификации, поэтому синтезированные в бактериальных системах белки нуждаются в дополнительном химическом преобразовании. Кроме того, белки, синтезированные бактериями, могут нести остатки бактериальных компонентов, что недопустимо для белков медицинского назначения.

В связи с этим в ряде случаев целесообразно использование эукариотических векторных систем. Эукариотические вектора имеют такую же структуру, как и прокариотические. Они должны содержать:

· эукариотический селективный маркер;

· эукариотический промотор;

· соответствующие эукариотические сайты терминации транскрипции и трансляции;

· сигнал полиаденилирования мРНК.