Репликация ДНК

Уотсон и Крик уже во второй своей работе 1953 года предположили возможный механизм копирования наследственного материала. Легко представить, что цепи молекулы ДНК расходятся и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две дочерние двуспиральные молекулы ДНК, неотличимые от родительской молекулы.

Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм копирования называется полуконсервативным.В то же время обсуждались две другие модели, одна из них "консервативная" другая "дисперсионная" (Рисунок). Доказали существование полуконсервативной модели М. Мезелсон и Ф. Сталь в 1958 году. Авторы выращивали бактерии Е. coli несколько поколений на минимальной среде, в которой единственным источником азота был ¹⁵NH₄C1 (хлорид аммония). В этом соединении нормальный изотоп ¹⁴N, был заменен на ¹⁵N. В результате все клеточные компоненты бактерий, включая пурины и пиримидины в молекулах ДНК содержали более тяжелый азот ¹⁵N. Затем клетки переносили на среду, содержащую изотоп ¹⁴N. Через 1 или 2 поколения выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте CsCl. Фракции, содержащие легкие или тяжелые цепи, а так же гибридные ¹⁵N/¹⁴N, легко отделялись одна от другой.

В 1957 году Артур Корнберг (в 1959 году Артуру Корнбергу (Arthur Kornberg) была присуждена Нобелевская премия за открытие механизма биосинтеза ДНК) обнаружил у бактерии Е. coli фермент, катализирующий процесс полимеризации ДНК из нуклеотидов – ДНК-полимеразу. Открытие Корнберга показало, что в основе удвоения молекул ДНК лежат обычные биохимические реакции. По современным представлениям в репликации ДНК у прокариот выделяют следующие этапы: 1. Релаксация суперспирализованной ДНК. Этот процесс катализируется ферментом топоизомеразой. 2. Денатурация двойной спирали ДНК.

Поскольку синтез ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно предшествовать обязательное разделение двух цепей ДНК. Участок начала расхождения цепей называется репликационной вилкой из-за характерной Y-образной формы. Именно в этой репликационной вилке ДНК-полимеразы синтезируют дочерние молекулы ДНК.

Модели репликации ДНК:

а - полуконсервативная, б - консервативная, в - дисперсионная.

Родительские цепи изображены в виде красных лент, вновь синтезированные

показаны синим цветом.

Участок ДНК, в котором репликация уже завершилась, выглядит как пузырек или "глазок" в нереплицированной ДНК. Репликационные глазки образуются в тех местах, где находятся специфические последовательности – точки начала репликации (origin of replication). Они состоят примерно из 300 нуклеотидов. С ориджина ими связываются инициаторные белки репликации.

Для того, чтобы цепи ДНК разъединились, функционирует особый фермент – ДНК-хеликаза, который связывается с инициаторными белками. Этот фермент движется по одиночной цепи ДНК и, встречая участок двойной спирали, он разрывает водородные связи между основаниями, разделяет цепи и продвигает репликационную вилку.

Субстратом для ДНК-полимеразы являются дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (дНТФ), полимеризующиеся на одноцепочечной матрице. ДНК-полимеразы последовательно наращивают одну нить ДНК, шаг за шагом присоединяя к ней следующие звенья в направлении от 5' к 3' концу. В клетках присутствуют несколько разных типов ДНКполимераз, выполняющих различные функции и имеющих разное строение: они могут быть построены из различного количества белковых цепей (субъединиц), от одной до десятков. Однако, все они работают на любых последовательностях нуклеотидов матрицы; задача этих ферментов - сделать точную копию каждой матрицы.

Генетический материал живых организмов имеет огромные размеры и реплицируется с высокой точностью. В среднем, в процессе воспроизведения генома млекопитающего, состоящего из ДНК длиной 3 млрд. пар нуклеотидов, возникает не более трех ошибок. При этом ДНК синтезируется чрезвычайно быстро (скорость ее полимеризации колеблется в пределах от 500 нуклеотидов в секунду у бактерий до 50 нуклеотидов в секунду у млекопитающих).

Высокая точность репликации, наряду с ее высокой скоростью, обеспечивается наличием специальных механизмов, осуществляющих коррекцию, т.е. устраняющих ошибки.

Суть механизма коррекции заключается в том, что ДНК-полимеразы дважды проверяют соответствие каждого нуклеотида матрице: один раз перед включением его в состав растущей цепи, второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь синтезируется лишь в том случае, если последний нуклеотид растущей цепи ДНК образовал правильную уотсон-криковскую пару с соответствующим нуклеотидом матрицы.