Использование обратной транскриптазы

Встраивания в хромосому реципиента

I этап. Получение генов или фрагментов ДНК для последующего

Самый важной и трудоемкой задачей при создании рекомбинантов является получение нужных генов или фрагментов ДНК для введения в клетки реципиентов. Имеется несколько методических приемов для осуществления этой задачи: синтез генов химическим путем, использование обратной транскриптазы, метод дробовика (дробового ружья).

Синтезгена химическим путем

Впервые был синтезирован ген аланиновой т-РНК дрожжей Кораной в 1969 г. после того, как была расшифрована последовательность нуклеотидов в нем (всего 77 пар нуклеотидов). Сначала синтезировали небольшие фрагменты по 4-13 п.н., а затем сшивали их лигазой. Однако этот ген оказался неактивным, так как не содержал регуляторных элементов.

В 1976 году Корана с сотрудниками добился успеха, синтезировав ген тирозиновой т-РНК кишечной палочки, который уже содержал промотор из 52 п.н., структурную часть из 126 п.н. и терминатор из 121 п.н.. После встраивания в геном мутантного фага Т4 ген заработал как естественный.

Для химического синтеза гена сначала должна быть установлена его первичная структура путем секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК или м-РНК, или с помощью анализа аминокислотного состава кодируемого геном белка. Для установления нуклеотидных последовательностей сейчас существует два подхода – метод Максама и Гилберта, основаный на химической модификации оснований и метод Сенгера на принципе полимеразного копирования с использованием аналогов нуклеотидов для терминации роста цепи. Вхорошо оснащенных генно-инженерных лабораториях имеются специальные приборы – секвенаторы, автоматически определяющие последовательности нуклеотидов в ДНК или РНК.

Задача синтеза гена значительно упростилась с открытием фермента обратной транскриптазы, обнаруженной впервые у РНК-содержащих ретровирусов. Ретровирусы используют обратную транскриптазу для синтеза ДНК-овой копии собственной РНК. Образующаяся при этом двухцепочечная молекула ДНК может легко интегрироваться в геном клетки-хазяина. В 1970 г. Темин и Митузани и независимо от них Балтимор выделили данный фермент из препарата внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. По механизму действия этот энзим является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, но чаще используются его тривиальные названия – обратная транскриптаза или ревертаза.

Обратная транскриптаза обладает по крайней мере тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) Активностью РНК-азы Н, гидролизующей цепь РНК в составе гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Первые две активности необходимы для синтеза вирусной ДНК, а эндонуклеаза очевидно участвует в интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина.

В генной инженерии обратную транскриптазу используют для получения ДНК-овой копии гена, если удается выделить из донорной клетки соответствующую гену m-РНК (матричную, информационную РНК).

Синтез гена с помощью ревертазы ведут таким образом: сначала в систему вводят m-РНК, набор ДНК-овых нуклеотидов, небольшие затравки для синтеза – праймеры – олиго (dT) и обратную транскриптазу, которая начинает синтезировать на матрице m-РНК комплементарную цепь ДНК; затем с помощью щелочного гидролиза удаляют m-РНК, а обратная транскриптаза «делает разворот», и используя только что образованную цепь ДНК как матрицу, синтезирует на ней еще одну комплементарную цепь. Для ускорения синтеза второй цепи ДНК на этой стадии иногда добавляют ДНК-полимеразу I E. coli, которая дублирует полимеризующую активность ревертазы. По окончании синтеза первая и вторая цепи ДНК оказываются связанными петлей в виде шпилечной структуры. Эту петлю расщепляют эндонуклеазой S 1, которая способна специфически гидролизовать одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. В результате получают полноценную ДНК-овую копию гена, которую можно легко встроить в вектор и ввести в клетку-реципиента.

Однако при использовании ревертазы есть свои сложности. Так, m-РНК не содержит регуляторных участков (промоторов и терминаторов), что вызывает необходимость достраивать их в векторе. Кроме того, выделить m-РНК в чистом виде достаточно сложно.

Метод дробовика (дробового ружья)

При невозможности синтезировать ген химическим путем или с помощью обратной транскриптазы используют технику Shot-gun – метод дробового ружья. Суть его заключается в том, что сначала ДНК дробят на фрагменты с помощью рестриктаз, то есть создают библиотку генов или фрагментов ДНК. Полученные ДНК-овые фрагменты гибридизируют «вслепую» с вектором, разрезаным той же рестриктазой. Гибридные векторы, содержащие встроенный ген методом трансформации переносят в бактерии (обычно в кишечную палочку) и размножают. Затем идентифицируют и отбирают необходимые колонии одним из перечисленных ниже методов (см. IV этап). Способ отбора на селективных средах осуществляют с помощью генетических маркеров – способности расти на средах с антибиотиком, если ген несет фактор устойчивости, неспособности расти на средах с антибиотиком, если ген устойчивости к этому антибиотику инактивирован путем встройки в него гибридного фрагмента (при этом используется метод реплик), способности расти на средах без ауксина, если в геном ауксотрофа по этому ауксину введен нужный ген. Если же соответствующий генетический маркер не найден, используют метод гибридизации.