Окраска по Граму
Способы окраски
Простой способ окраски. Использование одного вида красителя:
1. Растворы метиленового синего, время окраски 3-5 минут
2. Растворы фуксина, время окраски 1-2 минут
3. Растворы бриллиантового зеленого, время окраски 3-5 минут
Данный способ прост в работе, позволяет изучить форму клетки микроорганизмов, взаиморасположение.
Сложные способы окраски позволяют выявить определенные структуры микроорганизмов (капсулы, споры, жгутики, нуклеотид), провести дифференциацию видов микроорганизмов (Грам плюс и Грам минус кислотоустойчивые и некислотоустойчивые). При окраске сложным способом используют 2-3 красителя, протраву, дифференцирующее вещество.
Дифференциация микроорганизмов на Грам положительные и Грам отрицательные основано на различии строения клеточной стенки. У Грам положительных микроорганизмов в клеточную стенку входит многослойный пептидогликан, с которым связаны тейхоевые кислоты. Этот комплекс образует прочное соединение с генцианвиолетом, не разрушающееся при воздействии спирта 96º.
У Грам отрицательных микроорганизмов пептидогликан однослойный, тейхоевых кислот мало, больше фосфолипидов и липопротеидов, что создает непрочное соединение с генцианвиолетом, окрашиваясь дополнительным красителем — фуксином. Используемые красители: карболово-спиртовой генцианвиолет, фуксин Пфейффера. Протравка — раствор Люгеля. Дифференцирующее вещество — 96º этиловый спирт.
Грам положительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет — стафилококки, стрептококки, пневмококки.
Грам отрицательные окрашиваются в малиновый цвет — менингококки, гонококки.
Этапы окраски
1. На препарат кладут фиолетовую бумажку по Синёву и сверху наносят несколько капель физраствора. Окрашивают 1-2 мин.
2. Снять пинцетом бумажку с препарата, слить в лоток избыток краски
3. Не промывая препарат водой, нанести несколько капель раствора Люголя и держать до почернения препарата примерно 1 минуту.
4. Не промывая препарат водой, нанести сверху раствор 96º этилового спирта; держать до отхождения красителя
5. Промыть физраствором или стерильной дистиллированной водой
6. 
Докрасить фуксином Пфейффера — 3 минуты
7. Промыть физраствором или стерильной дистиллированной водой.
Самостоятельная работа:
1. Приготовить 2 препарата из микробной культуры.
2. Окрасить простым способом (м/с) и сложным по Граму
3. Провести иммерсионную микроскопию, зарисовать.
Занятие №4 «Изучение шаровидных форм бактерий. Окраска по Бури-Гинсу и Ожешко»
План занятия
1. Морфологические особенности шаровидных форм бактерий.
2. Тинкториальные свойства шаровидных форм бактерий
3. Окраска по Бурри-Гинсу и Ожешко
Знать
1. Морфологические структуры, размеры шаровидных форм бактерий
2. Микроскопию шаровидных форм
3. Методики окраски по Бурри-Гинсу и Ожешко
Уметь
1. Провести микроскопию демонстрационных препаратов шаровидных форм бактерий, зарисовать
2. Приготовить препарат из капсульных бактерий, окрасить по Бурри-Гинсу
3. Провести микроскопию, зарисовать
4. Приготовить препарат из споровой кульуры, окрасить по Ожешко, провести микроскопию, зарисовать.
Шаровидные бактерии — кокки имеют средний диаметр около 1 мкм. В зависимости от их расположения в мазке, что определяется характером деления клеток, патогенные кокки подразделяются на локки (двойной), стрептококки (цепочечный) и стафилококки (виноградная гроздь). Диплококки и стрептококки делятся в одной плоскости, но остаются соединенными цитоплазматическими мостиками. К диплококкам относятся:
1. Пневмококки — диплококки ланцетовидной формы
2. Менингококки — диплококки бобовидной формы
3. Гонококки — диплококки бобовидной формы.
Стафилококки делятся в двух плоскостях и образуют скопления клеток, напоминающие грозди.
Непатогенные кокки располагаются беспорядочно (микрококки) тетрадами и пакетами по 8-16 особей (сарцины). Тетракокки и сарцины делятся в двух-трех плоскостях.
Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют. Капсулы имеют только некоторые кокки, например пневмококки.
Тинкториальные свойства.
Гр +: стафилококки, стрептококки, пневмококки
Гр -: менингококки, гонококки