Клонирование организмов и клеток. 3 страница

К терапевтическому клонированию отношение более мягкое, что, видимо, вызвано его большей ценностью. Если трудно представить практическое применение репродуктивного клонирования (разве, что случаи бесплодия с невозможностью искусственного оплодотворения), то значение терапевтического клонирования, несомненно. Так, в Великобритании терапевтическое клонирование официально разрешено. При этом жестко ограничивается возраст эмбриона, с которым можно вести работу (в Британии - не более 10 недель).

Терапевтическое клонирование и его перспективы в медицине. Термин «терапевтическое клонирование» означает метод получения клеточных культур- трансплантатов, который заключается в том, что ядро соматической клетки пациента (например, кожных фибробластов) переносится в энуклеированный донорский ооцит. После процесса репрограммирования это ядро становится тотипотентным и инициирует формирование эмбриона, который на определенной стадии развития может использоваться для получения культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭС клетки), обладающих ядерным геномом пациента. Культура ЭС клеток подвергается воздействию веществ- индукторов, вызывающих направленную дифференциацию в определенный тип клеток, например, в такие как кардиомиоциты для замещения поврежденного участка миокарда или в синтезирующие инсулин бета-клетки островков Лангерганса. В настоящее время разрабатываются другие методы получения ЭС клеточных культур с использованием технологии генетической модификации генома для отбора дифференцированных популяций.

Успешно проведенные эксперименты по клонированию макак-резус американскими учеными Л. Менг и др. из центра по изучению приматов в Орегоне свидетельствуют о потенциальной возможности переноса технологии трансплантации ядер на человека. Л. Менг и соавт. получили двух макак-резус в результате переноса ядер бластомеров из ранних эмбрионов. Ввиду значительного сходства физиологии и генетики у человека и остальных приматов для изучения процессов репрограммирования генома, развития клонов, как во время протекания беременности, так и в постнатальный период и их эпигенетической стабильности нечеловеческие приматы могут служить самой оптимальной моделью.

Прежде чем станет возможным всерьез воспринимать заявления о внедрении терапевтического клонирования в медицине необходимо добиться клонирования обезьян с использованием соматических дифференцированных клеток. Эффективность реконструкции эмбрионов приматов будет зависеть от оптимизации многих параметров. Наши представления о процессах созревания яйцеклеток в условиях in vitro все еще являются неполными, требуют усовершенствования протоколы слияния кариопласта с цитопластом и активации генома. Электрослияние не считается в настоящее время наиболее эффективным методом для соединения донорского ядра с энуклеированной яйцеклеткой: электрический импульс вызывает одновременно активацию реконструированного ооцита, вследствие чего в ядре не успевают завершиться процессы репрограммирования ядра. Уже разработаны методики по индукции слияния с использованием фитогемагглютинина, этиленгликоля и микрохирургическими методами, которые не вызывают одновременную активацию. Это позволяет отсрочить ее индукцию у прооперированного ооцита на 4-5 ч.

Согласно вышеупомянутой методике И. Тезарик, П. Наги и др. в 2000 г. переносили кариопласты зрелых человеческих ооцитов в другие энуклеированные ооциты на стадии метафазы П. Учеными изучались слияние кариопласта с цитопластом и спонтанная и химическая активация реконструированной яйцеклетки. Эта технология, по мнению исследователей, может найти применение при лечении бесплодия, связанного с недостаточностью функции цитоплазматических компонентов яйцеклеток. К подобным экспериментам необходимо относиться с большой осторожностью, поскольку сама методика механического переноса кариопласта, воздействие на яйцеклетку химических агентов слияния могут иметь непредсказуемые последствия.

Даже внедряемая технология переноса незначительного количества цитоплазмы от ооцита здорового донора в реципиентную яйцеклетку пациента в настоящее время подвергается активной критике из-за возможной дисрегуляции во взаимоотношениях между ДНК ядра и митохондрий. Отрицательный эффект генетического химеризма может быть еще более сильным при тотальной замене цитоплазматического окружения кариопласта и проявиться в виде нарушений различной природы как во внутриутробный период развития, так и после рождения организма.

Новейшие технологии в области клонирования и создания эмбриональных стволовых клеток открывают огромные возможности для лечения многих заболеваний, связанных с дегенерацией определенных типов клеток, потерей функций тканей и целых органов. Около 16 млн. человек во всем мире страдают нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, свыше 120 млн. - диабетом и миллионы - артритами, СПИДом, инфарктами и другими заболеваниями, которые могут быть излечены с помощью применения клеточных трансплантатов.

По самым скромным подсчетам десятки наиболее распространенных заболеваний могут быть вылечены с внедрением клеточной терапии. Методы терапевтического клонирования позволяют избежать иммунного отторжения трансплантатов, поскольку ЭС клетки несут генетическую информацию донора ядер. Низкая эффективность трансплантации ядер не важна для осуществления клеточной терапии, так как для получения линии ЭС клеток достаточно всего одного или нескольких предимплантационных эмбрионов. Кроме того, сейчас рассматривается вопрос об использовании в качестве цитопластов энуклеированных яйцеклеток животных, например, крупного рогатого скота, которые поддерживают реализацию генетического материала ядра человеческой соматической клетки до стадии 5-дневного эмбриона.

Одной из перспективных сфер применения клонирования может оказаться ксенотрансплантация, то есть межвидовая трансплантация тканей и органов.

Некоторыми компаниями ведется работа по созданию линии свиней с инактивированным геном альфа-1,3-галактозилтрансферазы. Этот ген кодирует фермент, участвующий в синтезе поверхностных антигенов клеток свиней, которые обусловливают немедленное отторжение трансплантатов у приматов. Технология клонирования с использованием генетически модифицированных культур клеток в качестве доноров ядер значительно упростит процесс создания такой линии.

Важный результат получен американскими учеными, которым удалось разработать метод выращивания новых костей в позвоночнике крыс. В проведенных экспериментах ученые работали со стволовыми клетками. Они модифицировали их так, что стволовые клетки костного мозга стали экспрессировать белок ВМР-9, который способствует росту новых костей. Затем модифицированные клетки были инъецированы в одну сторону позвоночника крыс, в то время как в другую ученые инъецировали стволовые клетки, содержащие инактивированный ген. Через 8 недель после начала эксперимента был зафиксирован рост костей лишь на той стороне спины, которая содержала модифицированные стволовые клетки. При этом вновь образованные кости выглядели абсолютно нормально. Эта методика пока не была опробована на людях, однако исследователи полагают, что этот метод генной терапии, который включает в себя этап работы с клетками вне организма, является многообещающим для лечения заболеваний костей, а также показателем перспективности терапевтического клонирования вообще.

Не менее интересные результаты получили российские ученые. Им удалось клонировать из стволовых клеток человека кардиомиоциты.

Гематологическое клонирование. На определённой стадии развития эмбрион состоит из абсолютно одинаковых стволовых клеток. Позже они станут дифференцированными и будут отвечать за развитие разных органов. После рождения стволовые клетки продолжают оставаться в организме, обеспечивая обновление стареющих клеток, но с возрастом они по тем или иным причинам кончаются или погибают. Клетки перестают обновляться, что крайне пагубно влияет на здоровье человека и предположительно является причиной старения организма. Если бы стволовые клетки не погибали, возможно (это следует подчеркнуть) организм не был бы подвержен старению вообще или этот процесс проходил бы не так быстро. Гематологическое клонирование направлено на восполнение потерянных стволовых клеток, наличие которых должно оттянуть смерть пациента на как можно более долгий срок. Также оно может быть использовано для восстановления поврежденных органов.

Сам процесс выглядит следующим образом: из любой клетки пациента извлекается ядро, которое затем помещается в яйцеклетку. Начинается развитие. По истечении четырёх суток зародыш представляет крошечный пузырёк (бластоциста) заполненный стволовыми плюрипотентными (недифференцированными) клетками. Когда, по мере развития стволовые клетки стали мультипотентными (дифференцированными) и их количество достаточно велико, их можно извлечь и ввести пациенту. Самое трудное, что нужно сделать - это подтолкнуть плюрипотентные клетки к развитию в нужном направлении.

Важные результаты в этой области были получены в США. Согласно предварительным результатам, американские учёные находятся на заключительном этапе разработки технологии, которая позволит восстанавливать поврежденные возрастом или болезнью органы с помощью клонированных клеток этого же организма.

Исследователи компании Advanced Cell Technology (штат Массачусетс, США) клонировали клетки покровных тканей двух коров, после чего стволовые клетки крови, полученные из клонированных эмбрионов, имплантировались исходным животным. При этом иммунная система одной из коров подавлялась иммунодепрессантами. Согласно полученным результатам, колонии кровяных клеток, произошедших из клонов, проявляли удивительные заместительные способности: в частности, даже у животного с нормально функционировавшей иммунной системой, они вскоре составляли до 50% всей клеточной популяции. Механизм «омоложения» клеток не изучен. Выдвигаются версии относительно того, что данное явление связано с изменением состояния концевых участков хромосом, так называемых теломеров (см. 1.2).

В случае если новая методика зарекомендует себя как эффективная и безопасная, ее можно будет использовать для заместительной терапии больных лейкемией, а также автоиммунными заболеваниями, в частности, артритом. Кроме того, отмечается, что клонированные стволовые клетки крови могут способствовать восстановлению широкого круга других органов. Вероятно, такие регенеративные свойства связаны с тем, что «омоложенные» кровяные клетки более интенсивно уничтожают старые и дефектные клетки и структуры органов, тем самым, способствуя их обновлению.

Однако до того как описанная методика сможет быть применена в клинике, следует провести ещё большой объем исследований. В частности, сейчас необходимо выяснить, не могут ли клонированные клетки приобретать злокачественные свойства. Следует также отметить, что в случае с коровами, использовавшимися в опытах массачусетскими исследователями, стволовые клетки извлекались из 100-дневных эмбрионов, что ни в коем случае не допустимо в отношении человека. Сейчас учёные решают вопрос получения стволовых клеток на максимально ранних этапах развития зародыша.


 

ПРИЛОЖЕНИЯ