Исследование нуклеиновых кислот. Методы ДНК-диагностики 1 страница

Часть 3. Современные вопросы генных технологий

 

 

Методы исследования нуклеиновых кислот. Методы выделения ДНК из растительных и животных тканей и её очищение. Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. ДНК-зонды. Электрофорез ДНК. Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации. Саузерн-, Норзерн-, Вестерн-блоттинг. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in vitro. Полимеразная цепная реакция. Секвенирование ДНК.

Методы ДНК-диагностики. Показания к ДНК-диагностике. Прямые и непрямые методы. ДНК-чипы. Молекулярно-генетические методы исследования в судебной медицине.

Методы исследования нуклеиновых кислот.Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, в конечном счете, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70—80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику.

Чтобы познакомить с сутью и терминологией молекулярно-генетических методов, ниже схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует спе­циальной подготовки в соответствующих лабораториях.

Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех ме­тодов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (то­тальной или геномной) из клеток; б) накопление определённых фрагментов, которые предполагается анализировать, с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэто­му такие образцы называют геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культу­ры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала, например 20—40 мг хориона, 1 мл крови, 5—10 мг культуры клеток. Для осуществления некоторых методов достаточно иметь 1 каплю крови, соскоб эпителия со щеки или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому ещё можно добавить, что выде­ленная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов мето­дов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 мин., однако в большинстве случаев требуются более сложные методы.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК по Мармуру. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и.т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподготовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

Образцы тканей, получаемые при хирургических операциях, обычно фиксируют формалином и заливают в парафин. Такие фиксированные препараты также могут использоваться для проведения ПЦР.

Ферменты, используемые для генно-инженерных исследований. Рестриктазы. Одним из важнейших инструментов генной инженерии являются эндонуклеазы — ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим по­следовательностям нуклеотидов внутри цепи. Эти ферменты получили название рестриктаз. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках строго определенных последова­тельностей. Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических или физических воздействий, приво­дящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются частью защитной системы бактерий, охраняющих собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной ДНК. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRI свидетельствует о том, что этот фермент из Esherichia coli, ВатН1 — из Bacillus amilolquefacientsi. Каждый фермент узнает определенную 4-7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктаз Hpal), либо «липких», то есть перекрывающихся (например, ВатН1), концов. Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы. Любой фрагмент ДНК об­ладает характерным расположением сайтов узнавания различных ре­стриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участ­ки. Такие фрагменты можно разделить и идентифицировать методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Часть ферментов, применяемых для исследования ДНК, представлена в таблице 10.

ДНК-зонды. Информация обо всем многообразии организма заключена в его генетическом материале. Так патогенность бактерий определяется наличием в них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК детерминирующий данный биологический признак имеет строго определенную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот - спаривание двух комплиментарных сегментов разных молекул ДНК.

 

Табл.10. Основные ферменты, используемые в генной инженерии

 

 

Фермент Реакция Область приложениия
Рестриктазы Расщепляют ДНК по специфи­ческим последовательностям нуклеотидов Получение фрагментов ДНК, соз­дание химерных молекул ДНК
Нуклеаза Деградация как 5'-, так и 3 '-кон­цов ДНК Образование концевых делеций в молекулах ДНК
ДНК-лигаза Катализирует образование связей между молекулами ДНК «Сшивание» фрагментов ДНК
ДНК-полимераза I Синтез двухцепочечной ДНК по ДНК-матрице Синтез двухцепочечной ДНК
ДНКаза1 Вносит одноцепочечные разрывы в ДНК Картирование участков в ДНК
Экзонуклеаза-Ш Удаляет нуклеотиды с 3 '-концов ДНК Секвенирование ДНК
Экзонуклеаза Удаляет нуклеотиды с 5-концов ДНК. Секвенирование ДНК
Обратная транскриптаза Синтезирует ДНК по РНК-ма­трице Синтез кДНК по мРНК: картирование ДНК
   

 

 

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала.

Система детекции должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста гибридизационные ДНК- и РНК-зонды должны быть высокоспецифичнными. Другими словами необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствии последовательности мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности - мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижает специфичность зондов, которая может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК и РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представляют собой продукт химического синтеза, клонированные интактнные гены или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифических зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК- мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифициравать с помощью ПЦР.

В качестве примера использования ДНК-зонда для диагностики заболеваний можно привести процедуру обнаружения Plasmodium falciparum. Этот паразит вызывает малярию, заболевание, которое угрожает примерно трети всего населения Земли. Он инфицирует эритроциты и разрушает их, что приводит к развитию лихорадки, а в тяжелых случаях к поражению мозга, почек и других органов. Чтобы выявить источники инфекции, оценить эффективность мер по их ликвидации и обеспечить раннюю диагностику и лечение, необходимо достаточно чувствительные, простые и недорогие методы. В настоящее время малярию диагностируют с помощью микроскопического исследования мазков крови - эффективного, но трудоемкого и занимающего много времени процесса. Иммунологические методы обнаружения Plasmodium, такие как ELISA, достаточно быстрые и их легко автоматизировать, но с их помощью нельзя отличить текущую инфекцию от прошедшей, поскольку при этом определяются только наличие антител к Plasmodium в крови больного. Для избирательной ДНК-диагностики текущей инфекции, т.е. для выявления ДНК-возбудителя, в качестве основы используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК Plasmodium falciparum. Сначала с помощью ДНК-зонда проводят скрининг библиотеки геномной ДНК паразита. Затем отбираются клоны дающие наиболее интенсивный гибридизационный сигнал, поскольку именно они предположительно содержат высокоповторяющиеся последовательности. ДНК каждого из отобранных клонов проверяют на способность к гибридизации с ДНК видов Plasmodium, не вызывающих малярию. В качестве специфического зонда выбирается последовательность гибридизующейся ДНК с Plasmodium falciparum, но не с ДНК Plasmodium vivax, Plasmodium cynomolgi или с ДНК человека. С его помощью можно обнаружить всего 10 пг очищенной ДНК Plasmodium falciparum или 1 нг той же ДНК в крови больного.

Получено и охарактеризовано более 100 различных ДНК-зондов,
позволяющих обнаруживать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так имеются зонды для диагностики бактериальных инфекций человека, вызываемых Legionella рheumoniae (респираторные заболевания), Salmonella typhimurium (пищевое отравление), Campylobacter hyointestinalis (racтриты), a также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli (гастроэнтериты) однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно выявлять практически любые патогенные микроорганизмы.

В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошие отношение сигнал / шум. Радиоактивный меченый зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.

Однако 32Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечить безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы не радиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяют окраску, а второй - испускает свет.

Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда - «молекулярного маяка».

Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. К 5' концу присоединен флуоресцентный хромофор, а к 3' концу - не флуоресцентный хромофор, на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре маяк имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находиться в тесном контакте и флуоресценция флуорофора тушится. Когда 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНК- и РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя и зонд испускает свет. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарными соответствующей последовательности ДНК- и РНК-мишени.

Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путём сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

Идентификация фрагментов ДНК и РНК методами гибридизации в геле является либо ко­нечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Для идентификации и выделения, интересующих исследователя клонов бактерий с химерной ДНК разработан метод гибридизации в бак­териальных колониях. Для этого на многочисленные колонии бактерии, выращенные на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Часть бактерий прилипает к фильтру. После лизиса клеток, денатурации и фиксирования ДНК фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченым зондом. По окончании гибридизации фильтр отмывают от избытка зонда и выявляют образовавшийся меченый ги­бридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту из них, которая дала положительный сигнал.

Все разновидности методов гибридизации базируются на ком­плементарных взаимодействиях азотистых оснований разных цепей нуклеиновых кислот. Точное соответствие последовательностей гибридизующихся фрагментов приводит к быстрому образованию прочного устойчивого комплекса.

В целом методы гибридизационного анализа можна разделить на два типа:

· методы гибридизационного анализа, про­водимые в растворе (гомологичные);

· методы гибридизационного анализа, про­водимые на твердом носителе (гетерогенные).

Метод гибридизации в растворе. При гибридизации в растворе искомая нук­леиновая кислота и зонд свободно взаимодейст­вуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса гибридизации. Детекцию ре­зультатов гибридизации в растворе осуществля­ют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения оставшихся двухцепочеч­ных гибридов, содержащих меченый зонд.

Для успешного проведения реакции гибриди­зации в растворе необходимо применять одноце­почечные зонды, неспособные к самогибридиза­ции. Метод хорош еще и тем, что требует ми­нимальных объемов и количеств биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один существенный не­достаток — на его основе можно создать диа­гностические тест-системы для выявления специ­фических фрагментов небольших участков ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов или участков в исследуе­мом образце. Это снижает порог чувствительно­сти до уровня иммуноферментного анализа и да­же ниже.

Метод гибридизации на твердом носителе. Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют поли­мерный мембранный фильтр, например, нейло­новую мембрану.

В большинстве случаев процедуру проведе­ния анализа можно разделить на следующие стадии: подготовка образца (в том числе экстра­кция и выделение ДНК), фиксация пробы на носителе, предгибридизация, собственно гибридизация, отмывание не связавшихся продуктов, детекция.

Для подготовки пробы, может быть, необходи­мо предварительное «подращивание» исследуе­мого материала для идентификации отдельных колоний бактерий или увеличение концентрации вирусов в клеточной культуре. Проводится и непосредственный анализ образцов клеток, мочи, уретральных соскобов, форменных элементов крови или цельной крови на присутствие инфек­ционных агентов. Для освобождения нуклеино­вых кислот из состава клеточных структур про­водят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола. Денатурация ДНК, т.е. переход в одноцепочечную форму, происходит при обработке щелочью. За­тем образец нуклеиновой кислоты фиксируют на носителе — нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80°С в вакууме. Далее в процес­се предгибридизации достигается инактивация свободных мест связывания для уменьшения не­специфического взаимодействия зонда с мембра­ной. После чего искомые фрагменты ДНК (РНК) комплементарно связываются со специфичес­ким зондом, и тогда данный метод называют ДНК-зондовой диагностикой. Далее осуществля­ют детекцию одним из возможных методов (авторадиографическим, ферментативно-гибридизационным и т.д.).

Метод «сэндвич»- гибридизации. Метод является одной из разновидностей зондовой технологии (DNA-probe). При его исполь­зовании применяются два зонда, гомологичные различным участкам искомой нуклеиновой кис­лоты. Один зонд фиксируют на мем­бране для того, чтобы связать искомую нуклеи­новую кислоту, присутствующую в исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации проводят повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участ­ком ДНК (РНК).

Методы блот-гибридизации. Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК явля­ется более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом при ультра­фиолетовом облучении выглядит как более или менее равномерно окрашен­ная поверхность. Задача генетика — выявить специфические фрагменты ДНК.

ДНК, разделенную гель-электрофорезом, можно перенести с геля на нитроцеллюлозный фильтр. Для этого ее денатурируют в геле щелочью, нейтрализуют гель, и затем прикладывают к нему нитроцеллюлозный фильтр, обеспечивая медленный ток буфера через гель и фильтр. Денатурированная ДНК диффундирует и задерживается на фильтре, после нагревания, которого в вакууме она «запекается» и иммобили­зуется, т. е. обездвиживается на фильтре. Ее распределение на плоскости фильтра точно такое же, как и на плоскости геля. Однако в отличие от геля фильтр с ДНК можно использовать для последующей гибриди­зации с меченой пробой, т. е. с мечеными ДНК и РНК. Для этого инкубируют фильтр с раствором, содержащим меченую пробу, при повышенной температуре, затем тща­тельно отмывают его и, наконец, подвергают авторадиографии, т. е. выдерживают с рентгеновской фотопленкой. При проявлении последней на ней выявляются полосы, соответствующие полосам ДНК на фильтре, сгибридизовавшимся с радиоактивной пробой.

Процедура переноса ДНК с геля на фильтр обознача­ется английским термином blotting (промокание). Поэтому для таких фильтров с ДНК используется термин «блот» (blot). По имени автора Э. Саузерна эти блоты называются «блотами Саузерна» (Southern blots).

Вместо ДНК можно перенести на фильтры с геля РНК. Такие фильтры называют Норзерн-фильтрами [игра слов: фамилия Саузерн означает «южный»; фильтры с ДНК по Саузерну — южные блоты; фильтры с РНК шутливо обоз­начили как северные блоты (Northern); фильтры с бел­ками— как западные (Western)].

Чтобы про­водить гибридизацию с Саузерн- и Норзерн- фильтрами, содержащими весьма малые количества индивидуальных ДНК и РНК, были нужны очень высокомеченные пробы. Их научились делать путем энзиматического введения метки в выделенные препараты нуклеиновых кислот. Наи­более распространенный метод — это так называемая ник-трансляция (nick-translation). ДНК инкубируют с двумя ферментами, ДНК-полимеразой I и ДНКазой I (последняя берется в ничтожных количествах вместе с высокомеченными предшественниками ДНК, дезоксирибонуклеозидтрифосфатами). ДНКаза вносит в двухцепочечную ДНК одноцепочечные разрывы. На эти места садится ДНК-полимераза и разрушает одну из цепей ДНК, одновременно заново ее застраивая, но используя при этом меченые предшественники. Таким образом, большая часть ДНК замещается радиоактивной, сохраняя при этом свою нуклеотидную последовательность. Есть и другие методы вклю­чения метки в ДНК и РНК.

Рассмотрим блот-гибридизацию по Саузерну (1975). Эта методика состоит из нескольких этапов этапов (рис.49).

После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухцепочечные фрагменты ДНК теряют связи и стано­вятся одноцепочечными.

Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр про­изводится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. Из-за капиллярного эффекта созда­ётся ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверх­ности. После переноса одноцепочечные нити фиксируют на фильтре. Распо­ложение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцен­тной

 

 

Рис.49. Блот-гибридизация по Саузерну

 

 

меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (16—30 пар нуклеотидов) либо клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично ком­плементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, проис­ходит гибридизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на филь­тре. Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью спе­циальной процедуры. Радиоактивно меченые участки выявляют путём экс­понирования фильтра с рентгеновской плёнкой (авторадиография). После проявления на плёнке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактив­ные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител. Блот-гибиридизация — высокочувствительный, но дорогостоящий и тру­доемкий метод выявления специфических после­довательностей ДНК.

Метод норзерн-блот-гибридизации — Northern-blot. Метод используется для определения уров­ня экспрессии гена путем количественной оцен­ки иРНК. Метод сложный и длительный по выпол­нению (5—7 суток). Трудности связаны с необ­ходимостью блокировать при выделении РНК так называемые РНКазы, которые чрезвычай­но стабильны и устойчивы по отношению ко мно­гим химическим процедурам, применяемым при экстракции РНК. Процедуры блот-гибридизации по Э. Саузер­ну и нозерн-блот-гибридизации не нашли применения в клинической микробиологии, поскольку они трудоемки. Точками приложения данных методов явились задачи, связанные с проведением научных исследований и задач по изучению геномной структуры ДНК (РНК), а также для выявления точечных мутаций.

Метод гибридизации in situ (ISH - in situ hybridization). Метод основан на проведении процессов гиб­ридизации непосредственно на срезе или в мазке с использованием любых зондов. Частная методи­ка гибридизации in situ — FISH (fluorescent in situ hybridization), позволяет установить наличие патогена в препаратах, фиксированных в форма­лине, и залитых парафином срезах и пунктатах ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе. Метод гибридизации in situ ба­зируется на основных принципах гибридизации твердофазной и гибридизации в растворе. Чув­ствительность метода гибридизации in situ огра­ничена возможностью проникновения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мише­нью. Процесс гибридизации проходит в тканях, при этом зонд снабжен флуоресцентной меткой. После промывки материала и удаления несвязавшихся молекул осуществляется детекция, для чего мазок или срез просматривают в флуоре­сцентном микроскопе. Метод ISH сложен для осуществления и по сравнению с другими моле­кулярными методами малочувствителен. Метод наиболее удобен для определения мишеней, например, вирусов в инфицированных клетках, ко­торые представлены большим числом копий.

Метод разветвленной ДНК (branch-DNA). Искомая нуклеиновая кислота связывается с улавливающим зондом, один конец которой ком­плементарен мишени, а другой — определенно­му концу усиливающего зонда. При этом усили­вающий зонд может быть комплементарен сле­дующему зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофора­ми, которые по мере увеличения количества свя­занных зондов усиливают (хеми-, флуоро-) лю­минесценцию. Преимуществом данного метода является возможность использования в одной ре­акции нескольких улавливающих и связывающихся с мишенью зондов, что обеспечивает вы­явление агентов, характеризующихся значитель­ной геномной гетерогенностью, например, вирус иммунодефицита человека.