Молекулярные механизмы генных, хромосомных и геномных мутаций 2 страница

Хромосомные аберрации обнаруживаются цитогенетическим методом под световым микроскопом. У человека известна транслокационная форма болезни Дауна, когда часть 21 хромосомы во время мейоза присоединяется к 15-й и вместе с ней через гаметы попадает в зиготу,где появляются три 21 хромосомы. Крупные хромосомные аберрации в зиготах приводят к тяжелым аномалиям, несовместимым с жизнью или гибели зародышей на начальных стадиях эмбриогенеза.

Современные методы изучения кариотипа человека. Хромосомный комплекс вида со всеми его особенностями: числом хромосом, их формой, наличием видимых в световой микроскоп деталей строения, генным и аллельным составом называется кариотипом. Специфичность набора хромосом для каждого вида. Все живые организмы имеют постоянное число специфических хромосом в каждой соматической клетке. Диплоидное число хромосом (2п) для человека — 46, для дрозофилы — 8, для лошади — 66, шимпанзе — 48, собаки — 78 и т. д. Гаплоидное число (п) для человека — 23, дрозофилы — 4 и т. д. Гаметы обычно содержат только один набор хромосом.

Число хромосом в кариотипе индивидуума не зависит от высоты организации вида и не указывает на филогенетическое родство, т. к. одно и то же количество хромосом может встречаться у очень далеких друг от друга видов. Особенность проявляется в том, что каждый вид организмов имеет специфичный набор хромосом определенной формы и размеров. А главное, хромосомы организмов разных видов имеют свой Уникальный набор генов, определяющих развитие индивидуумов только определенно вида.

Микроскопические методы изучения хромосом человека применяются с конца XIX века. Соединение цитологического наблюдения хромосом с генетическим анализом сегрегации и сцепления генов привело к рождению цитогенетики. Термин «цитогенетика» введён В. Саттоном в 1903 г. Первоначально цитогенетика концентрировалась на проблемах корреляции генетических и цитологических (хромосомных) признаков. В последующем цитогенетика методически отделилась от генетики, и под термином «цитогенетика» понимают область науки, изучающей структуру и функции хромосом.

Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Наиболее распространённым методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями. Во всей медико-генетической практике применяется световая микроскопия (главным образом в проходящем свете), включая люминесцентную микроскопию.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Каждый из этих объектов имеет преимущества и недостатки. Выбор объекта определяется целью исследования. Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках.

Получение препаратов митотических хромосом. Первое главное условие цитогенетической диагностики — наличие делящихся клеток в цитологическом препарате.

Костный мозг, ткани семенника и хорион имеют достаточный митотический индекс для того, чтобы использовать эти объекты для цитогенетических целей. Однако, как показал опыт, несравненно информативнее исследование на культурах клеток: клетки освобождены от элементов соединительной ткани и хорошо суспендируются. Митотический индекс в культуре клеток намного выше, чем в тканях организма.

Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови. Для её получения достаточно взять 1—2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Последний вызывает иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Продолжительность культивирования составляет 48-72 ч.

Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы. Митотический индекс в культуре клеток за 2—3 ч повышается в 2—3 раза. Даже без культивирования экспозиция с колцемидом увеличивает число метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой. В тех случаях, когда необходим детальный анализ определённого района хромосомы, сильно конденсированные хромосомы на стадии метафазы (метод называется метафазным) непригодны для анализа. Для этих целей клетка должна быть зафиксирована на стадии, предшествующей метафазе, когда хромосома редуплицировалась, но ещё не полностью конденсировалась. Эта стадия — стадия прометафазы. Хотя хромосомы на данной стадии плохо разъединены (они ещё очень длинные) и на препарате имеется много наложений одной хромосомы на другую, все же в отдельных клетках можно найти участок, необходимый для анализа. Этот метод (или подход) в отличие от метафазного метода называют прометафазным или методом высокоразрешающей цитогенетики. Суть методического вмешательства при данной модификации метода состоит в прекращении процесса спирализации и конденсации хромосом в профазе с помощью препаратов, которые вводят в культуру клеток за несколько часов до фиксации.

Дифференциальное окрашивание хромосом.Метод простой окраски хромосом как единственный метод изучения кариотипа человека применялся до начала 70-х годов. В 70-х годах в практику вошли методы дифференциального окрашивания и хронологии репликации ДНК в хромосомах.

Дифференциальное окрашивание обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (тёмные и светлые полосы). Протяжённость этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Как видно из рис. 37.б, при дифференциальной окраске идентифицируются все хромосомы, плечи и даже определённые районы. Каждая хромосома имеет свой рисунок исчерченности. При дифференциальной окраске метафазных хромосом в кариотипе можно оценить около 200-400 участков. Такова разрешающая возможность метода.

Рис.37. Кариотипы при простой (а) и дифференциальной (б) окраске

Первоначально при специальном окрашивании хромосом использовали флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом. Данный метод требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

В последующем была разработана методика дифференциальной окраски без флюоресцентных красителей. Наиболее широко используется G-окраска (Гимза). При этом хромосомы предварительно обрабатывают (либо инкубация в солевом растворе, либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, которая в некоторых участках восстанавливается при окраске, что и придаёт хромосоме индивидуальную исчерченность, или полосатость. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты — гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.

Для идентификации хромосом, помимо методов выявления линейной структурной дифференцированности, можно воспользоваться одной из важных характеристик хромосом человека – асинхронностью их репликации по длине (рис.38).

«Рисунки» последовательности репликации (рано или поздно реплицирующиеся участки) специфичны для каждой хромосомы. Для выявления

Рис.38. Метафазная пластинка с дифференциальной окраской сестринских хроматид

последовательности репликации применяется аналог тимидина 5-бромде-зоксиуридин. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо. Используя этот метод, можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку. Введение аналога 5-бромдезоксиуридина в культуру на 24 ч и более применяется для дифференциальной окраски сестринских хроматид. Если 5-бромдезоксиуридин ввести на полный клеточный цикл, то вновь образуемая хроматида включит аналог тимидина и будет окрашиваться слабо. Другая хроматида (старая) окрашивается, как обычно, интенсивно (рис.38.). Этот метод позволяет легко выявлять обмены между сестринскими хроматидами (СХО), число которых увеличивается при наследственных болезнях с хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, пигментная ксеродерма и др.). Число СХО увеличивается также при мутагенных воздействиях, поэтому метод учёта СХО широко используется при изучении мутационного процесса у человека.

Молекулярно-цитогенетические методы. Благодаря успехам молекулярной генетики человека разработан принципиально новый метод изучения хромосом — метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Принцип этого метода состоит в следующем (схема):

Для изучаемой хромосомы или конкретного её участка, исходя из специфичности последовательности оснований ДНК, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой «помеченный» участок ДНК называется зондом.

На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК-зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.

После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединиться к биотину или дигоксигенину. Как видно на схеме, для биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксигенина — антидигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин — красный цвет или флюоресцеин изотиоцианат — зелёный цвет).

С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных.

На схеме рассмотрена двойная гибридизация. Современные методические возможности позволяют увеличить число цветов.

Границы применения метода FISH очень широкие: от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Следует подчеркнуть, что соединение молекулярно-генетических и цитологических методов делает почти неограниченными возможности диагностики хромосомных аномалий, как очень сложных, так и очень мелких по размерам.

Рис.39. Схема двойной специфической флюоресцентной гибридизации in situ

Дву- и трёхцветная флюоресцентная гибридизация in situ применяется для учёта симметричных хромосомных аберраций у лиц, облученных много лет назад ионизирующими излучениями. Указанный метод требует меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных метафаз (рис.39.).

В клинической цитогенетике метод FISH занимает всё большее место. В случаях сложных хромосомных перестроек, захватывающих более двух хромосом, дифференциальная G-окраска не всегда позволяет идентифицировать изменённые сегменты хромосом. В этих случаях применяют трёхцветный вариант метода FISH. Например, у ребёнка с множественными врождёнными аномалиями при G-анализе обнаружены сложные перестройки в 6 хромосомах (1,4. 7, 8, 9 и 12) с 10 разрывами. Полная идентификация разрывов возможна только с помощью FISH-окраски.

Метод FISH может применяться для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Принцип метода в этом варианте такой же, как и для метафазных пластинок (описан выше). Например, специфичный для хромосомы 21 зонд ДНК, соединённый с биотином, гибридизируется с денатурированными клетками из амниотической жидкости на предметном стекле. В норме, т.е. если у плода есть дисомия по хромосоме 21, в ядре будут видны две флюоресцирующие соответствующим цветом точки. Если у плода трисомия, то в ядре будут видны 3 точки. Такой методический приём называют интерфазной цитогенетикой. Метод прост, экономичен и требует мало времени (несколько часов).

Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH— comparative genome hybridization). Область использования метода — онкологическая цитогенетика. Назначение метода — определение районов хромосом, которые делегируются или амплифицируются в определённом типе опухоли. Районы делеций, как правило, содержат гены-супрессоры опухолевого роста, а районы амплификации содержат онкогены. Таким образом, метод используется в большей степени для картирования и клонирования генов, вовлечённых в канцерогенез.

Иногда бывает достаточно сложно получить хромосомные препараты хорошего качества из солидной опухоли или у больных с гематологическими онкозаболеваниями, поэтому был разработан оригинальный метод косвенного анализа хромосом в опухоли. Суть метода CGH в том, что из опухоли выделяют ДНК и метят её определённым флюорохромом. ДНК, выделенную из нормальной ткани, метят другим флюорохромом. Хромосомные препараты готовят стандартным способом из лимфоцитов периферической крови контрольного индивида. Меченую ДНК из опухоли и неизменённой ткани гибридизируют с хромосомным препаратом. По интенсивности свечения метки определяют области делеций и амплификации. Область разрешения —5—10 млн пар нуклеотидов. Для обработки данных используют программы компьютерного анализа хромосом.

Спектроскопический анализ хромосом (SKY). Этот метод использует флюоресцентные красители, имеющие сродство к определённым участкам хромосом. При использовании набора специфических зондов с разными красителями каждая пара хромосом имеет свои уникальные спектральные характеристики. Особенность метода — использование интерферометра, аналогичного используемым для измерения спектра астрономических объектов. Незначительные вариации в спектральном составе, неразличимые человеческим глазом, учитываются при компьютерной обработке, и затем программа назначает каждой паре хромосом легко распознаваемые цвета. Результат в виде цветного изображения чаще используется в цифровой форме. Анализ кариотипа значительно облегчается, поскольку гомологичные хромосомы имеют один и тоже цвет, а аберрации становятся легко различимыми. Кроме того, спектральное кариотипирование используется для выявления транслокаций, не распознаваемых традиционными методами. Область использования метода — онкоцитогенетика. Благодаря такому подходу удаётся точно описать множественные структурные перестройки хромосом, происходящие в опухолевых клетках. В клинической цитогенетике удаётся определять очень незначительные по величине транслокации, инсерции и маленькие маркерные хромосомы. Однако использование метода ограничено высокой стоимостью оборудования для анализа.

Показания для цитогенетического исследования достаточно широкие, особенно при акушерско-гинекологической и детской патологии. Ниже приводится перечень (возможно, неполный) состояний, при которых с диагностическими целями надо иметь результаты цитогенетического исследования, проведённого у пациента (пробанда) и при необходимости у его родственников.

Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

Наличие у ребёнка множественных врождённых пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врождёнными пороками развития.

Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.

Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребёнка с хромосомной болезнью).

Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учёт хромосомных аберраций и СХО).

Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения).

Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических). Медицинских ограничений для применения цитогенетических методов нет.

Однако необходимо помнить, что эти методы трудоёмкие, дорогие, назначение их наугад неоправданно (по принципу «если неясно, то давайте назначим»). Правильнее назначать цитогенетическое исследование по рекомендации врача-генетика после проведения медико-генетического консультирования. Опыт работы зарубежных медицинских учреждений показал необходимость создания цитогенетических лабораторий при больших многопрофильных больницах и медико-генетических консультациях, комплексно обслуживающих какой-либо район или город. В Украине цитогенетические исследования проводятся в медико-генетических кабинетах и медико-генетических консультациях.

Класссификация мутаций по причине возникновения. В зависимости от причин возникновения мутации могут быть спонтанные или индуцированные. Спонтанные — это мутации, которые происходят в природе внезапно без видимых причин под действием каких-то факторов. Индуцированные — это мутации, происходящие при направленном воздействии определенных мутагенов.

До 1925—1927 гг. генетики имели дело только со спонтанными мутациями. Различные попытки повысить частоту мутаций, в том числе и предпринятые Т. X. Морганом, не приносили успеха. Создавалось впечатление, что мутационный процесс не зависит от окружающей среды. Это стимулировало автогенетические концепции, согласно которым эволюцию организмов связывали только с действием внутренних факторов.

Овладение методами индуцированного мутагенеза сыграло огромную роль в борьбе с такими тенденциями, а также расширило возможности генетического анализа. Впервые повышение частоты наследственной изменчивости под влиянием внешних агентов обнаружили в 1925 г. советские микробиологи Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов. Они наблюдали увеличение разнообразия наследственных форм — сальтантов, как они их назвали, после воздействия «лучами радия» на низшие грибы.

В 1927 г. Г. Мёллер сообщил о действии рентгеновых лучей на мутационный процесс у дрозофилы и предложил ставший классическим количественный метод учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме у этого объекта. Почти одновременно Л. Стадлер (1928) описал влияние рентгеновых лучей на мутационный процесс у ячменя. В том же году М. Н. Мейсель в лаборатории Г. А. Надсона получил мутации у дрожжей под действием химических соединений (хлороформ и др.).

В 30-х годах открыт химический мутагенез у дрозофилы: сначала В. В. Сахаров (1932), а затем М. Е. Лобашев и Ф. А. Смирнов (1934) показали, что некоторые соединения (йод, уксусная кислота, аммиак) способны индуцировать рецессивные летали в Х-хромосоме. В 1939 г. С. М. Гершензон открыл сильный мутагенный эффект экзогенной ДНК у дрозофилы. Мощные химические мутагены были открыты в 1946 г. И. А. Рапопортом (этиленимин) в СССР и Ш. Ауэрбах и Дж. Робсоном (азотистый иприт) в Англии.

С тех пор в арсенал мутагенных факторов вошли разнообразные химические соединения: аналоги оснований, включающиеся непосредственно в ДНК, такие агенты, как азотистая кислота или гидроксиламин, модифицирующие основания, соединения, алкилирующие ДНК (этилмегансульфонат, метилметансульфонат и др.), соединения, интеркалирующие между основаниями ДНК (акрихины и их производные), и многие другие. Наряду с мутагенами были найдены вещества-антимутагены.

Возможность изменять скорость мутационного процесса послужила решающим стимулом к выяснению причин спонтанных мутаций. Одна из первых попыток объяснить причины спонтанных мутаций сводилась к предположению о том, что в действительности их индуцирует естественный фон радиоактивности. Однако выяснилось, что таким путем можно объяснить возникновение лишь около 0,1 % всех спонтанных мутаций у дрозофилы. Не подтвердилась и гипотеза о тепловом движении атомов как главной причине спонтанных мутаций. Были попытки объяснить спонтанные мутации результатом действия продуктов метаболизма клетки и организма.

Современная точка зрения на причины спонтанных мутаций сформировалась в 60-х годах благодаря выяснению механизмов воспроизведения, репарации и рекомбинации генов и открытию ферментных систем, ответственных за эти процессы. Возникла тенденция объяснять генные мутации как ошибки в работе ферментов матричного синтеза ДНК. Сейчас эта гипотеза общепризнана. Притягательность гипотезы заключается также в том, что она позволяет рассматривать и индуцированный мутационный процесс как результат вмешательства внешних факторов в нормальное воспроизведение носителей генетической информации, т. е. дает единое объяснение причин спонтанных и индуцированных мутаций. Большое влияние на развитие теории мутационного процесса оказало изучение его генетического контроля. Были открыты гены, мутации которых могут повышать или понижать частоту как спонтанных, так и индуцированных мутаций. Эти и другие факты, убедительные аргументы в пользу существования общих причин индуцированного и спонтанного мутационного процесса.

Первое объяснение механизма мутационных изменений (генных мутаций и хромосомных аберраций) было предложено в 1935 г. Н. В. Тимофеевым-Ресовским, К. Циммером и М. Дельбрюком на основании анализа радиационного мутагенеза у высших организмов и прежде всего у дрозофилы. Мутация рассматривалась как результат мгновенной перестройки атомов в сложной молекуле гена. Причиной такой перестройки считалось непосредственное попадание в ген кванта или ионизирующей частицы или же случайные колебания атомов.

Открытие в дальнейшем эффекта последействия ионизирующих излучений показало, что мутации возникают в результате процесса, длящегося во времени, а не непосредственно в момент прохождения кванта энергии или ионизирующей частицы через ген.

Перспективы преодоления этих и других противоречий зарождающейся теории мутационного процесса были намечены в физиологической гипотезе мутационного процесса, высказанной 1946 г. М. Е. Лобашевым.

Сущность гипотезы М. Е. Лобашева заключалась в том, что «благодаря способности клетки репарировать полученные повреждения становление мутации должно осуществляться в процессе обратимости повреждения, т. е. в процессе восстановления (репарации)». Это означало, что появлению мутации должно предшествовать предмутационное состояние или потенциальное изменение, которое может быть устранено (тождественная репарация) либо реализуется в виде мутации (нетождественная репарация). Для доказательства существования таких предмутационных состояний М. Е. Лобашев, его ученики К. В. Ватти, М. М. Тихомирова и другие в опытах с дрозофилой, облученной рентгеновыми лучами, дополнительно воздействовали на нее высокой температурой, которая сама по себе мутаций практически не вызывала. Мухи, подвергнутые такому комбинированному воздействию, обнаруживали более высокую мутабильность, чем после воздействия только рентгеновыми лучами.

Несмотря на то, что физиологическая гипотеза мутационного процесса была сформулирована на основе общепринятых в то время представлений о белках как носителях генетической информации, она оказалась справедливой и в отношении молекул ДНК. Действительно, многие повреждающие агенты приводят к локальной денатурации молекул ДНК, а устранение этих нарушений структуры (репарация) — к возникновению мутаций. Связь мутаций с процессами репарации в настоящее время доказана практически для всех исследованных объектов. Ныне физиологическая теория выросла из рамок гипотезы, символизируя современный период в изучении мутационного процесса.

Мутагенные факторы. Загрязнение окружающей среды опасно не только ныне живущему поколению, но часто представляет опасность для грядущих поколений, поскольку многие загрязнители мутагенны (или, что почти то же самое, генетически активны). Выявление и устранение генетически активных факторов из среды обитания человека — задача генетической токсикологии, которая представляет собой наиболее активно развивающийся раздел экологической генетики. Это объясняется ее огромным прикладным значением.

Парадоксально, но факт, что открытие индуцированного мутационного процесса потребовало значительных усилий от исследователей: вспомним, что Г.Дж. Меллер получил Нобелевскую премию за открытие мутагенного действия рентгеновых лучей (1927 год). Теперь же мутагены обнаруживаются на каждом шагу. Многие продукты производственной деятельности человека, появляющиеся как результат так называемого технического прогресса, обладают генетической активностью. При этом мы говорим не только об отходах производства. Это могут быть лекарства, консерванты, пищевые добавки и красители, косметика, инсектициды и пестициды, не говоря уже о дыме сигарет и излучениях, сопровождающих «мирный атом», тем более оружие массового уничтожения — ядерное и химическое. Сложнее обстоит дело с новыми, как правило антропогенными, факторами внешней среды, которые никогда не встречались в природе в ходе биологической эволюции. Так, например, многие инсектициды — хлорированные углеводороды никогда не существовали в природе. Они не трансформируются в пищевых цепях и потому неразложимы биологическим путем, что не учитывалось при их применении. К ним относятся полихлорбифенилы, в частности пестициды: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) — эффективные дефолианты. Притчей во языцех становятся в последнее время диоксины, также относящиеся к полихлорированным бифенилам и представляющие собой самые активные яды, известные в настоящее время. Один из них входил в состав печально известного agent orange, применявшегося армией США во Вьетнаме в качестве боевого дефолианта. Диоксины образуются также при сжигании мусора в больших количествах на заводах по уничтожению городских отходов.

В списке наиболее значимых антропогенных факторов загрязнения среды (из 19 наименований) первые пять мест занимают: 1) пестициды; 2) тяжелые металлы; 3) диоксид углерода; 4) диоксид серы и продукты ее окисления, взвеси; 5) разливы нефти, сточные воды промышленных предприятий. При этом радиоактивные отходы, обладающие несомненной генетической активностью, стоят только на 12-м месте как загрязнители.

В генетической токсикологии принято говорить не только о мутагенах, но и, более широко, о генетически активных факторах. Не всегда удается определить непосредственно мутагенный эффект того или иного воздействия, но можно показать его влияние на кроссинговер, то есть на рекомбинацию генов или индукцию репаративного синтеза ДНК, сопровождающего многие повреждения генетического материала.

Таким образом, мутагенез, рекомбинагенез и индукция репаративного синтеза ДНК — это показатели генотоксичности или генетической активности исследуемого фактора.

Генетически активные факторы делятся на физические, химические и биологические. К физическим факторам относятся температура, ионизирующая радиация, ультрафиолетовый свет, по-видимому, высокочастотное электромагнитное излучение, ультразвук и т.д. Химические генетически активные факторы гораздо труднее поддаются перечислению и классификации. Достаточно сказать, что к ним относятся любые вещества, прямо или косвенно нарушающие структуру и воспроизведение молекул ДНК. Выхлопные газы автотранспорта и выбросы в атмосферу производственных предприятий содержат алкилирующие соединения (их называют радиомиметиками), органические соединения ртути, полициклические углеводороды, обладающие генетической активностью. Многие химические соединения сами по себе не проявляют генетической активности, но их легко активируют внутриклеточные метаболиты, а иногда и соединения, находящиеся в окружающей организм среде. Например, распространенные соли азотной кислоты легко превращаются в нитриты (соли азотистой кислоты) — мутагены, дезаминирующие основания ДНК. В кислой среде желудка млекопитающих нитриты и аминосо-единения дают нитрозосоединения — супермутагены, нарушающие репликацию ДНК. Многие вещества, так называемые промутагены, активируются в организме млекопитающих при действии цитохрома P-450. Этот фермент, синтезируемый в печени, относится к классу неспецифических монооксигеназ и предназначен для инактивации чужеродных соединений, попадающих в организм. Но Р-450 вместе с тем способен активировать некоторые промутагены. Более того, он может активировать не только промутагены, но и потенциальные канцерогены — вещества, вызывающие рак. Необходимо отметить высокий уровень корреляции между мутагенным и канцерогенным эффектами многих факторов, прежде всего физических и химических.

Особый интерес представляют биологические генетически активные факторы. В конце 30-х годов С.М. Гершензон установил мутагенный эффект ДНК и вирусов. Позже было выяснено, что хромосомные аберрации в соматических клетках вызывают вирусы оспы, кори, ветряной оспы, гриппа, гепатита. Стрептолизин-О, токсин гемолитического стрептококка, повышает частоту мутаций в культуре эмбриональных фибробластов человека. В контроле частота хромосомных аберраций составляет 4,0 ± 0,5%, а при действии токсина - 24,3 ± 0,6%. Ю.Я. Керкис показал мутагенный эффект иммунологического стресса при пересадке и отторжении в силу тканевой несовместимости кожного лоскута у мышей. Мощным мутагеном биологического происхождения оказался афлатоксин — продукт жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillusflavus.