Соматическая гибридизация

Разработка способов индукции слияния протопластов вместе с развитием экспериментальной техники культивирования клеток in vitro, дающей возможность получения изолированных протопластов, их культивирования и образования каллуса и в дальнейшем целого растения, сформировало новый очень интересный и перспективный метод гибридизации растений — парасексуальную, или соматическую, гибридизацию.

Сущность этого способа гибридизации заключается в том, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а клетки тела (сомы) растений, из которых изолируют протопласты.

Соматическая гибридизация — это метод создания неполовых гибридов путем слияния изолированных про­топластов, полученных из соматических клеток. Гибридизация со­матических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов (родов, семейств) растений, между кото­рыми невозможно половое скрещивание, но и сочетать в гибрид­ной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Для получения гибридных клеток растений приготавливают протопласты путем разрушения клеточных стенок соответствующими ферментами. Слияния протопластов добиваются обработкой их полиэтиленгликолем (ПЭГ) или другими химическими препаратами. ПЭГ способствует агрегации протопластов. Собственно слияние мембран происходит только тогда, когда суспензию отмывают от ПЭГ раствором с высоким рН и высоким содержанием Са²⁺, которые существенно увеличивают текучесть мембран до фазового разделения и слияния.

Другим способом получения соматических гибридов является электрослияние. Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, можно объяснить следующим образом. Импульс короткой продолжительности вызывает диэлектрическое разрушение соприкасающихся мембран протопластов. Вокруг дырки возможен обмен липидными молекулами, образование липидных мостов, что в конце концов приводит к слиянию мембран. Это энергетически более выгодное состояние, чем существование двух поврежденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липидов, отражают особенности жидкой мозаичной структуры клеточной мембраны и могут быть связаны с ее текучестью.

В отличие от полового скрещивания, где имеет место передача цитоплазмы только от материнского организма, при соматической гибридизации в образовавшемся гибриде оба партнера имеют более или менее равный цитоплазматический статус. Слияние протопластов способствует объединению двух различных цитоплазм. В большинстве исследований слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, ядро — одного. Образование растения с гибридной цитоплазмой и органеллами обоих партнеров, но содержащее в своих клетках ядро только одного вида, возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер и одно ядро дегенерирует.

Важным моментом в изучении индуцированного слияния двух неродственных протопластов является селективный маркер, используемый для идентификации продукта гетероплазматического слияния, так как эффект индуктора не специфичен и вызывает агрегацию и слияния протопластов как одного и того же вида, так и различных видов. Для идентификации гетероплазматического продукта могут служить пластиды. Например, в случае индуцируемого ПЭГ слияния протопластов сои и капусты гетерокарион получал хлоропласты от капусты и плотную цитоплазму и неокрашенные пластиды от протопластов сои. При межродовом слиянии протопластов табака и моркови как селективные маркеры использовались зеленые хлоропласты табака и красные, содержащие антоциан, протопласты моркови. Четко различимы были продукты слияния при межвидовой гибридизации между протопластами двух видов Torenia. Протопласты Т. fournieri, содержащие антоциан, комбинировались с протопластами Т. baitlonii, содержащими только хромопласты или только хлоропласты. Кроме пластид могут быть использованы биохимические и генетические маркеры, такие, как изоферментный состав, структура нуклеиновых кислот, устойчивость к антибиотикам, число хромосом, кариотипы.

Основной недостаток метода соматической гибридизации — низкая частота регенерации соматических гибридов, особенно межвидовых и межродовых. В связи с этим соматическую гибридизацию широко применяют у видов с высоким регенерационным потенциалом in vitro, прежде всего семейств Пасленовые, Капустные, Сельдерей­ные, Лилейные.

С помощью соматической гибридизации между культурными растениями и дикими видами были получены: сорта картофеля, устойчивые к вирусным заболеваниям, фитофторозу, колорадско­му жуку; томаты, устойчивые к вирусу табачной мозаики.

Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.

Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные. Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу «У», чем отличался от полового гибрида.

Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид. Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.

Ю. Ю. Глебой с сотрудниками проводились многочисленные эксперименты по созданию межтрибных гибридов. Триба - таксономическая единица между семейством и родом. Получены удачные гибриды между арабидопсисом и турнепсом - арабинобрассика. У гибридных линий индуцировали морфогенез корней и растения. Растения были уродливы, имели очень много тератомоподобных образований, похожих на цветки.

Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых дурмана и красавки. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.

В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.

Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.

Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 - аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные - зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.

Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.

Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.

Для отдаленных гибридов характерно:

1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.

2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).

3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.

4. Ограниченная морфогенетическая способность.

Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.