Техника культивирования на этапах микроклонального размножения.

На 1 этапе необходимо получить хорошо растущую стерильную культуру. Экспланты стерилизуют в стерилизующих растворах, при необходимости используют антибиотики для уничтожения внутренней инфекции. На 1 этапе используют среду М-С. в которую вводят биологически активные вещества (БАВ), стимуляторы роста, ауксины и цитокинины в различных сочетаниях. С помощью антиоксидантов можно избавить от воздействия токсикантов экспланты. В качестве антиоксиданта можно использовать аскорбиновую кислоту, в питательную среду иногда добавляют активированный уголь для адсорбции токсинов. Продолжительность 1 этапа от 1 до 2 месяцев, в результате культивирования эксплантов наблюдают рост меристемных тканей и формирование первичных побегов.

Собственно микроразмножение - 2 этап. На этом этапе получают максимальное количество меристематических клонов. Здесь используют ту же питательную среду М-С, БАВ, регуляторы роста, при этом качество питательных сред может отличаться по концентрации цитокининов. Чередуют питательные среды с повышенным и пониженным содержанием цитокининов. Цитокинины (при их продолжительном действии) могут повлиять на корнеобразование растений, предусмотренное 3 этапом.

3 и 4 этапы. Включают укоренение микропобегов, их адаптацию почвенным условиям и высадку в поле. Состав питательной среды на 3 этапе значительно отличается от питательных сред 1, 2 этапа. На 3 этапе полностью исключают из среды цитокинины, оставляют только ауксин, сокращают количество углеводов в питательной среде.

Корнеобразование индуцируется 2 способами:

1) Выдерживание побегов в течение нескольких часов (2-24 часа) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-50 мг на литр), далее побеги продолжают культивировать на агаризованной среде без гормонов или в почвенном субстрате.

2) Культивирование микропобегов в течение 33-4 недель на питательной среде с содержанием ауксина 1-5 мг на литр.

Пересадка растений регенерантов в субстрат это завершающий и самый сложный процесс микроклонального размножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с 2-3 листьями, хорошо развитой корневой системой пинцетом вынимают из колб, пробирок и переносят в стерильный почвенный субстрат. Режим стерилизации: 85-90 ⁰ С в течение 1-2 часов. В качестве субстратов используют торф, песок в соотношении 3:1.

Культивирование проводят в торфяных горшочках, горшочки с растениями помещают в теплицы при t 20-22⁰ , освещенностью 5 тыс.люкс, влажностью 65-90%. Растения закрывают стеклянными банками, полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают, достигнув полной адаптации. Через 20-30 дней после посадки укоренившиеся растения подкармливают комплексными минеральными удобрениями. По мере роста растения пересаживают в большие ёмкости. После акклиматизации применяют классическую агротехнику выращивания культур.

Пробирочные растения часто утрачивают способность образовывать корневые волоски и регулировать транспирацию. В первом случае рекомендуют применение микориза образующих факторов (н-р, микроорганизмов), при этом предусмотрено культивирование пробирочных растений и микоризаобразующих грибов в питательных средах. Во втором случае можно обрабатывать растения 50%-ным водным раствором глицерина. Этот метод позволяет избежать процесс закаливания пробирочных растений и обеспечивает их 100%-ную их приживаемость.

5.10