И ЕГО ПОДГОТОВКА

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЭКСПЕРИМЕНТ

Лекция 6

1.1. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

В настоящее время разработаны различные методы оценки токсичности химических веществ, включающие острые, подострые и хронические исследования. Основное различие между ними состоит в применяемых дозах и продолжительности воздействия химического вещества. Каждый из методов требует, чтобы группы здоровых лабораторных животных, содержащихся при соответствующих условиях, подвергались воздействию градированных доз исследуемого вещества. Для этих целей обычно используют крыс, мышей, морских свинок, кроликов, хомяков, но в некоторых случаях может возникнуть необходимость включения в исследование других видов животных. Как правило, контрольная группа животных получает растворитель (носитель исследуемого вещества) или инертное вещество. После воздействия вещества тщательно наблюдают за появлением признаков его токсичности. Лабораторные исследования, имеющие целью определение характера биологического действия изучаемого вещества, выполняют на опытных и контрольных группах животных. Все данные в отношении каждого животного подробно записывают. По завершении исследования все животные, в том числе и контрольные, подлежат патаморфологическим исследованиям. Полученные данные должны быть проанализированы с помощью соответствующих статистических методов.

Наименьшие концентрации вредного вещества, вызывающие тот или иной эффект, называют пороговыми. Пороговые концентрации, вызывающие острое отравление, всегда значительно больше, чем вызывающие хроническое отравление.

В токсикологии выявляются пороги однократного, хронического действия вещества, его физиологический порог (минимальное воздействие вещества, в результате которого можно обнаружить реакцию живого организма). Пороговые дозы и концентрации служат для количественного сравнения токсичности вещества на относительно низком уровне. При выявлении порогов используют такие показатели реакций, как двигательная активность, масса опытного животного, мышечная сила, нервно-мышечная возбудимость, состояние терморегуляции, функции печени, почек, сердечно-сосудистой системы, биохимические показатели крови. В опыте яды вводятся подкожно, внутрибрюшинно, перорально, с помощью ингаляционных затравок. Для газов и паров желательноопределить их пороговые концентрации в воздухе. Опыты с животными дополняют исследованиями на людях-добровольцах. Определение пороговых концентраций в хроническом опыте длится не менее 4 мес. Безопасные, предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в несколько раз ниже пороговых, вызывающих физиологические нарушения при резорбтивном однократном воздействии. Особенно малы ПДК тяжелых металлов.

Острая токсичность определяется как вредное действие, проявляющееся в течение короткого периода после введения разовойдозы или многократных доз, вводимых в течение суток. Исследование острой токсичности направлено на установление количественных параметров токсичности данного химического соединения, изучение характера его действия и специфического токсического эффекта, а также на установление существующих видовых и половых различий в чувствительности к токсическому агенту.

Значение DL50 обычно определяют путем расчетов. Гибель животных после однократного воздействия вещества может наступить не сразу: сроки смерти зависят от механизма действия вещества, поэтому в токсикологии принято наблюдать за животными в течение 14 сут.

Если вещество не обладает выраженной токсичностью, то определить смертельные дозы, даже вводя максимально возможные объемы вещества, не удается. В таких случаях, чтобы получить примерные сведения о верхних параметрах токсичности, продолжают ежедневное введение возможно большей дозы, регистрируя время гибели животного и суммарное количество введенного яда.

Оценку результатов производят на основании среднего эффективного времени гибели животных. Следует отметить, что при использовании этого метода не требуется достижения гибели всех животных группы.

Пороговая, или минимальная, токсическая доза при однократном введении токсического вещества определяет нижнюю зону острой токсичности вещества. Но уловить те слабые функциональные изменения, которые характеризуют пороговое действие, нелегко. В таких случаях наиболее применимы интегральные методики.

При выявлении верхнего параметра токсичности вещества следует учитывать, как быстро наступают симптомы отравления и смерть. Эти наблюдения могут в какой-то степени характеризовать токемкодинамику яда. Обычно можно разграничить несколько стадий острого отравления: 1) скрытая стадия, которая продолжается от момента введения яда до первых признаков его действия на организм; 2) продромальная стадия, характеризующаяся начальными, неясными инетипичными явлениями; 3) стадия нарастания отравления; 4) стадия высшего развития, когда все симптомы отравления, представляющие характерную для данного яда картину, достигают наибольшей силы. Эта стадия заканчивается гибелью животного или переходит в пятую стадию разрешения, когда начинается явное уменьшение действия яда.

При действии больших доз, когда смерть наступает почти моментально или в очень короткие сроки, выявить отдельные стадии отравления не представляется возможным.

В ряде случаев после отравления, иногда даже однократного, можно отметить так называемое метатоксическое действие яда. Под этим термином понимают наличие более или менее отдаленных последствий отравления, не связанных с непосредственным действием яда. Показательным примером может служить поражение почек, обнаруживаемое спустя длительное время после перенесенного отравления сулемой.

При изучении картины острой интоксикации учитывают время развития отравления, сроки гибели животного, а при выживании - быстроту восстановления функций организма.

При проведении токсикологического эксперимента многое зависит от умения экспериментатора наблюдать за животными, за появлением тех или иных симптомов отравления, чтобы, суммировав их, выявить характерное действие яда.Воздействие токсических веществ оценивают по изменению внешнего вида, состояния и поведения животных: наблюдают за двигательной активностью и координацией движений (характер походки, сохранение равновесия и т. д.), выявляют наличие тикообразных движений головы, тремора, судорог и их характер (клонические, тонические), парезов и параличей, определяют тонус мускулатуры пуrем пальпации различных групп мышц животного, выявляют реакции животного на звуковые, тактильные и болевые раздражители.

Токсические вещества в начале своего действия часто вызывают у животных явления возбуждения центральной нервной системы, как правило, сопровождающиеся повышенной двигательной активностью. Животные усиленно, часто беспорядочно, двигаются, прыгают, бросаются на стенки клетки. Иногда наблюдаются явления стереотипии: например, мыши бегают по кругу, крысы вращаются вокруг своей оси, как бы вальсируют. Реакция животных на незначительные раздражения бывает резко повышенной вплоть до агрессивной. У мышей иногда наблюдается симптом Штрауба: мышь держит хвост вертикально, «трубой», за счет гипертонуса приводящих мышц, что свидетельствует о распространении возбуждения на нижележащие области центральной нервной системы, в частности на спинной мозг. Походка у животных становится шаткой, движения- некоординированными. Начинаются судорожные явления. При этом признаки возбуждения нередко сменяются угнетением центральной нервной системы. Явления угнетения в зависимости от механизма действия яда могут возникнуть и с самого начала отравления, без предварительного периода возбуждения. Животные перестают двигаться, иногда как бы «застывают» на месте, сбиваются в кучку. Реакция на раздражители сначала понижается, а затем животные вообще перестают реагировать на какие бы то ни было раздражители, в том числе и болевые. Наступает так называемое боковое положение, в некоторых случаях, когда тонус мышц повышен, животным можно придавать любое, даже неестественное положение. Боковое положение может переходить в коматозное состояние.

На основании изучения поведения животных выясняется картина возбуждающего или угнетающего действия яда на центральную нервную систему. Возможно даже примерно определить ту часть нервной системы, которая задета действием исследуемого вещества.

Характерным признаком воздействия яда часто является изменение цвета кожных покровов. Одним из наиболее постоянных симптомов отравления служит изменение дыхания. Изменяются глубина дыхания и его ритм. Одно из типичных нарушений ритма дыхания характеризуется тем, что после нескольких, иногда все углубляющихся дыхательных движений наступает дыхательная пауза, продолжающаяся 5-10 с. Затем опять следует несколько дыханий, опять пауза и так далее (так называемое дыхание Чейн-Стокса). Изменяются количественные показатели: дыхание может настолько ускориться, что его трудно визуально сосчитать, или, наоборот, замедляется так, что его, например, легко учесть у мышей, у которых в норме визуально определить частоту дыхания довольно сложно.

Изменение сердечной деятельности также служит ярким показателем действия яда.

Часто, особенно при введении токсических веществ в желудок, преобладают патологические явления со стороны желудочно-кишечного тракта (рвота, понос, запор, отказ от еды и т. п.). Следует обращать внимание на изменение цвета, консистенции, частоты испражнений. У мышей подсчитывают число дефекаций за 1 ч или 2 ч. Имеют значение изменения мочи, частота мочеотделения. Учет данных, полученных при наблюдении за отравленными животными, позволяет определить характерные особенности в действии яда.

Погибших животных, а также выживших, которых умерщвляют по окончании срока наблюдения с помощью наркоза (эфиром или барбитуратами), а также диоксида углерода, подвергают патологоанатомическому исследованию, сравнивая их с контрольными.

1.2. СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ

Токсичность химических соединений зависит от ряда параметров: химической структуры вещества, его физико-химических свойств, условий воздействия на организм (доза, концентрация, время действия и т. д.). Большое значение имеет путь введения изучаемого вещества: ингаляционный- с вдыхаемым воздухом; пероральный- введение в желудок (через рот); перкутанныйпоступление через кожу; внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутрикожный и др. Каждый путь имеет свои особенности, которые необходимо учитывать при проведении токсикологического эксперимента, так как эффект при различном поступлении вещества может быть неодинаковым. Скорость всасывания вещества при различных способах введения также неодинакова. Неидентичной может быть и клиническая картина отравления при действии токсиканта, поступающего в организм различными путями.

Быстрота и сила действия токсического вещества, попавшего в желудок, во многом зависят от степени наполнения желудка пищевой кашицей и от ее характера. В пустом желудке вещества сразу вступают в непосредственный контакт со слизистой желудка, вследствие чего всасываются быстрее. Имеется достаточно примеров, когда химическое соединение, попав в желудок, полностью теряет токсичность или она значительно уменьшается (кураре, яды змей и насекомых). Вещества, не растворяющиеся в кислой среде, могуг проходить через желудок не всосавшись, но всасываться в щелочной среде кишечника. Многие яды в биологических средах желудочно-кишечного тракта растворяются лучше, чем в воде, в связи с этим увеличивается и их всасывание.

На быстроту и силу действия токсических веществ могут заметно влиять различные изменения внешних условий, отражающиеся на процессах всасывания в желудочно-кишечном тракте (температура, давление, влажность воздуха).

Большое значение имеет и общее состояние организма. Известно, что при многих заболеваниях всасывание в желудке и кишечнике резко уменьшается.

Из желудочно-кишечного тракта токсическое вещество распространяется по лимфатической и кровеносной системам в различные органы. Важную роль в превращении и обезвреживании ядов играет печень, особенно ферменты микросомальной фракции. Благодаря антитоксической барьерной роли печени ряд токсических веществ теряют или уменьшают свое отравляющее действие.

Токсические вещества можно вводить перорально в их чистом виде, в растворах, эмульсиях, суспензиях или с пищей и питьевой водой.

При введении веществ в чистом виде имеется уверенность, что наблюдаемое действие зависит именно от исследуемого вещества, а не от растворителей или каких-либо других побочных примесей. Представляется возможность точно дозировать вводимое вещество.

К растворам химических соединений прибегают в тех случаях, когда приходится манипулировать с очень малым количеством вещества (0,01 мл и меньше) или если вещество обладает раздражающим действием и это явление надо уменьшить, чтобы выявить характерное влияние данного вещества на весь организм, а не только на слизистые оболочки пищеварительного тракта.

Растворитель может сам по себе изменить скорость и силу действия яда. Чем концентрированнее раствор, тем в большем количестве он всасывается и тем большую токсичность проявляет. Наоборот, всасываясь в сильно разведенном виде, токсические вещества в ряде случаев успевают в организме обезвредиться. Поскольку скорость всасывания многих веществ зависит главным образом от концентрации, а не от объема, для получения сопоставимых результатов более целесообразно вводить несколько отличающиеся количества вещества, но в одинаковой концентрации.

Характер растворителя также играет немаловажную роль. Лучше всего в качестве растворителя использовать воду, так как она сама по себе не вызывает токсического действия и всасывание в желудочно-кишечном тракте при этом не нарушается.

В последнее время для стандартизации токсикологических приемов предлагается использовать рафинированное растительное масло. Однако большие объемы его могут не всосаться, а эвакуироваться вместе с испытуемым веществом через кишечник. Если вещества (как жидкие, так и твердые) не растворяются в воде или масле, то их вводят в виде эмульсии или суспензии. В качестве эмульгатора может служить 1-2 %-й раствор крахмала. Исследуемое вещество смешивают с раствором крахмала в определенных соотношениях (l: 1, 1: 5, 1: 10), что зависит от физико-химических свойств исследуемого вещества и выявляется экспериментальным путем. В этиловом спирте растворяются многие химические соединения. Однако сам по себе этанол может изменить эффект исследуемого вещества. Следует учитьmать, что спиртовые растворы ядов всасьmаются в желудке быстрее, чем водные и особенно масляные.

Изучаемые вещества вводят непосредственно в ротовую полость, в желудок через зонд, а также с пищей или питьевой водой. Выбор каждого из этих способов обусловливается физико-химическими свойствами изучаемого вещества. Малые количества изучаемого вещества можно вносить непосредственно в ротовую полость.

Введение химических веществ с пищей и питьевой водой является наиболее физиологичным способом. Одноразового переполнения желудка не наступает, а пища или вода поступает в желудок постепенно. Однако в этих случаях труднее учитывать количество поступившего в организм вещества.

Исследуемые вещества вводят животным до кормления, натощак, лишая корма за 4 ч до опыта. Кормить экспериментальных животных следует через 4 ч после воздействия токсиканта. Введение в желудок производится с помощью различных зондов - металлических, стеклянных, пластмассовых или резиновых. При введении зонда следует избегать малейшего насилия: зондом можно поранить стенки глотки, пищевода, желудка.

Введение большого количества жидкости, особенно если оно производится повторно, нарушает водный обмен и вызывает ряд патологических симптомов. Принято считать, что наиболее физиологичным является введение растворов в минимальных количествах, в объемах, не превышающих 1-1 ,5 % массы тела опытных животных.

Максимальное количество жидкости, которое можно ввести голодному животному за один прием, соответствует вместимости его желудка, что, в свою очередь, зависит от величины животного.

Мышам массой 20-25 г можно ввести в желудок до 1,0 мл жидкости, крысам массой 200-300 г -до 5,0 мл. Биологически активные вещества в виде растворов или вытяжек чаще вводят внутрибрюшинно или внутримышечно. Изучаемые вещества инъецируют в мышцу или брюшную полость животного.

В брюшную полость можно ввести 5 мл - крысам и 2 мл - мышам, а внутримышечно - соответственно 5 мл и 0,5 мл жидкости.

Не всегда изучаемые соединения высокотоксичны, однако, при отсутствии сведений о токсичности следует обращаться с изучаемым веществом как с ядовитым, принимая все меры предосторожности.

1.3 ВЫБОР И ПОДГОТОВКА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ К ЭКСПЕРИМЕНТУ

Прежде чем начать токсикологический эксперимент, необходимо четко определить задачу исследования, выбрать объект исследования (вид животных), метод введения вещества, установить длительность опыта.

Выбор животных для эксперимента является весьма ответственным моментом. В первую очередь учитывают такие факторы, как видовая чувствительность, возраст и пол животных. Под видовой чувствительностью понимают неодинаковое отношение животных различных видов к одному и тому же яду.

При определении показателей токсикометрии рекомендуется производить опыты не менее чем на двух видах животных, а именно на лабораторных мышах и крысах. Определение среднесмертельной дозы следует проводить как на самцах, так и на самках, поскольку у них прослеживается разница в величинах DL50, которая, вероятно, частично может быть обусловлена различиями в метаболизме вещества в печени животных разного пола. Острая токсичность может существенно меняться с возрастом исследуемых животных.

Кроме того, животные перед исследованием не должны использоваться для других экспериментов, а также подвергаться воздействию любых фармакологических препаратов. Число используемых животных должно быть достаточным для статистического анализа и зависит от метода расчета DL50. Обычно для каждой дозы используют группу из 8-10 животных. Масса выбранных животных должна соответствовать массе половозрелых особей, для мышей- 18-20 г, а для крыс- 180-240 г.

Исходный период постановки токсикологического эксперимента можно условно разделить на следующие этапы:

• подбор требующихся по условиям опыта животных;

• наблюдение, карантин и выбраковка больных животных;

• определение исходных значений исследуемых показателей - фона;

• выбраковка животных с резко выделяющимися значениями показателей;

• распределение по группам;

• статистическая проверкаотсутствия межгрупповых различий.

1.4. УСЛОВИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Немаловажное значение для токсикологического эксперимента имеют условия содержания подопытных животных. Содержание животных в условиях, вызывающих у них стресс (одиночное содержание в пенале, грубая фиксация в нефизиологическом положенин), приводит к увеличению токсичности. Изменения в питании также сказываются на показателях токсичности. Для экспериментальных исследований в токсикологических лабораториях используют крыс линии Вистар или белых беспородных крыс, которые являются альбиносами черной (Rattus rattus) и серой (пасюк- Rattus norvegicus) крыс, а также белых мышей, которые являются альбиносами домовой мыши (Mus musculus). И крысы, и мыши принадлежат к одному и тому же отряду грызунов (Rodeпtia), семейству мышиных (Muridae).

Важное преимущества белых крыс как лабораторных животных заключается в том, что они довольно устойчивы к инфекционным заболеваниям и дают большой приплод.

Белых крыс содержат в помещениях с хорошей вентиляцией, достаточным освещением и равномерной температурой - 20- 22 ·С. Лабораторные крысы плохо переносят холод. Влажность воздуха в помещениях не должна превышать 40-45 %. Для содержания крыс наиболее пригодны цельнометаллические или полистироловые клетки, покрытые сеткой из нержавеющей или оцинкованной стали. Минимальная площадь дна клетки на одно животное составляет для крыс 150 см ² .

В качестве подстилки для животных используют крупные опилки, измельченный торф или сечку из соломы или бумаги, тряпки. В клетках поддерживают надлежащую чистоту. Они должны быть всегда сухими, чистыми, хорошо вентилируемыми. Не допускают скопления в них мочи и фекалий.

Кроме ежедневной уборки клетки 1-2 раза в месяц тщательно моют и дезинфицируют. Дезинфицировать клетки лучше всего крутым кипятком, горячим 5-10%-м раствором едкой щелочи или такими противомикробными средствами, как хлорная известь, креолин, сулема, формалин и др.

Крысы - всеядные животные, поэтому нельзя ограничивать их рацион только растительной пищей. Крысы, не получающие в необходимых количествах продукты животного происхождения (молоко, мясо, мясокостную муку), минеральные вещества и витамины, перестают расти.

Суточная потребность взрослой крысы в кормах составляет в среднем 30-32 г, из них 25 г смешанного корма и 5-7 г овощей.

Кормят крыс обычно 2 раза в сутки. Ввиду того что крысы ночные животные и едят в темное время суток, основную часть корма следует давать вечером, примерно к 20 ч. Не рекомендуется резко менят~ пищевой режим, к новой пище крыс нужно приучать постепенно. Вода для питья должна быть чистой и свежей, рекомендуется пользоваться кипяченой водой. Заменять воду молоком также надо постепенно, в противном случае животные отказываются от еды и заболевают.

Содержание и кормление мышей во многом сходно с содержанием и кормлением лабораторных крыс. Отличием является то, что мыши более чувствительны к нарушениям температурного режима, смене корма и инфекционным заболеваниям (в частности, сальмонеллезу). У мышей в гораздо большей степени, чем у крыс, проявляется «социальная» иерархия в группе - борьба за лидерство, вследствие чего не рекомендуется изменять состав мышей в клетках.

Суточная потребность взрослой мыши в кормах составляет в среднем 9,5-10 г смешанного корма и 1-2 г овощей.

1.5. МАРКИРОВКА ЖИВОТНЫХ

Иногда при проведении экспериментальных работ требуется индивидуальное наблюдение за животными. Рассаживать их по отдельным клеткам не рекомендуется, так как при одиночном содержании изменяется сопротивляемость организма к отдельным токсическим веществам (например, судорожным ядам). Хороший выход из этого положения - маркировка животных. Можно прокалывать животным уши, выбривать шерсть и т. д., но лучшим способом маркировки является окрашивание. Наилучшей краской считается насыщенный раствор пикриновой кислоты (в сухом виде она взрывоопасна). Можно делать метки 0,5%-м раствором генцианвиолета, фуксина, эозина и другими красками. Если маркировка животных предусматривает только разделение их на группы, то лучше всегопокрасить каждую группу животных разным цветом. Если же возникает необходимость маркировки каждого животного, то применяются более сложные системы окрашивания. Так, например, бинарная система, предложенная Я. Буретом и др. (1991), позволяет осуществить индивидуальное кодирование 63 крыс.

Следует помнить, что нанесение краски не всегда безопасно для организма, так как она может всасываться и попадать при вылизывании животными шерсти внутрь.