Лабораторно- практическое занятие № 7

Тема: Методы культивирования микроорганизмов. Питательные среды.

Цель работы:Ознакомить студентов с методами культивирования аэробов и анаэробов, а также с видами питательных сред (простые, элективные, дифференциально – диагностические, естественные и искусственные).

Выращивание микроорганизмов на питательных средах назы­вают культивированием (от лат, cultus — выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы — культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или пленку, при развитии на плотной среде — колонии. Культура может быть чистой — содержать потомство клетки только одного рида и накопительной — состоять преимущест­венно из клеток одного вида микроорганизмов. Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо ис­следуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стериль­ную питательную среду для получения чистой или накопи­тельной культуры называют посевом. Перенесение уже выра­щенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом, или пассированием (от лат. passus — чере­дование).

Обычно микроорганизмы выращивают при определен­ной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов. Культивирование при определенной температуре называется инкубацией, или инкубированием (от лат. incubatio — выращивание, высиживание птенцов). Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посуду, не бывшую в употреблении, очищают от щелочи кипячением и растворе, содержащем К₂Сг₂0₇ (6%) и концентрирован­ную H₂SO₄ (6%).

В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно ¹/₃ пробирки, для анаэробных — ²/₃. Если плотная среда в пробирках предназначена для последую­щего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации ее наливают на ¹/₃ —¹/₄ объема пробирок.

После стерилизации пробирки с еще не застывшей сре­дой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки — косые или скошенные среды. Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называетсястолбиком. Столбики питательной сре­ды, занимающей ¹/₃ - ¹/₂ объема пробирки, используют для по­сева культуры уколом. Столбики питательной среды, занимаю­щие ²/₃ объема пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для мик­робиологических посевов. Пробирки со средами и культурами во время работы ус­танавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленны­ми к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении — в картонные коробки. При культивировании микроорганизмов в колбах ис­пользуют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных мик­роорганизмов колбу заполняют на ²/₃ объема. В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды — около 1,5 см, диаметр — 8—10 см, причем диаметр верхней чашки (она слу­жит крышкой) несколько больше диаметра нижней. Для работы с микроорганизмами используют специаль­ные бактериологические иглы, петли и шпатели. Их изготовляют из платиновой проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. При посевах и пересевах культур микроорганизмов из колоний, выросших на плотных средах, применяют иглы или шпатели. Суспензии мик­роорганизмов берут петлей.

Техника посева.Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. При посеве клеток микроорганизмов из пробирки в пробирку обе пробирки (одну — с культурой, другую — со стерильной питательной средой) берут в левую руку. Одну пробирку зажимают между указательным и средним пальцами (первая пробирка). Нижний конец ее свободно лежит на большом пальце (с его левой стороны). Вторую пробирку зажимают между средним и безымянным пальцами. Она должна лежать параллельно первой. При взятии мазка пробирки должны находиться в наклонном положении, гарантирующем стерильность культуры. При вертикальном расположении пробирок возможно попада­ние из воздуха посторонних клеток микроорганизмов.

В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую иглу (петлю), держа ее в правой руке в отвесном положе­нии. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью. Пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и пе­реносят во вторую пробирку. При высеве в плотную скошенную среду иглой с культу­рой легким движением, не повреждая среды, проводят пря­мую или волнообразную черту по ее поверхности — посев штрихом. При посеве в столбик питательной среды иглу вводят к толщу ее центральной части — посев уколом. При посеве в жидкую среду (или из жидкой среды) лишь слегка накло­няют пробирки, чтобы избежать смачивания пробок и краев пробирок. Пробки, перед тем как ими закрыть пробирки, обжигают в пламени. Удобнее сначала закрыть первую пробирку, а затем — вторую.

Хранение микроорганизмов.При длительном хранении в лабораторных условиях могут из­мениться отдельные физиолого-биохимические или морфоло­гические особенности микроорганизмов. Чтобы избежать это­го, необходимо хранить культуру чистой и в жизнеспособном состоянии. Традиционный метод хранения — пассирование (субкуль­тивирование), т. е. пересев на свежие питательные среды с вре­менными интервалами в зависимости от вида микроорганизма, среды и условий хранения. Одни виды микроорганизмов тре­буют частых пересевов, другие можно не пересевать более ме­сяца. В процессе такого хранения нельзя допускать пересыха­ния среды. Для этого пробирки с культурами рекомендуют обертывать бумагой или пленкой и хранить в условиях, когда процессы жизнедеятельности заторможены, например, в холо­дильнике при 5—8 °С. Существует ряд других способов хранения культур: под слоем стерильного вазелинового масла; в ампулах с жидким азотом; в лиофилизированном состоянии, т. е. высушенными из замороженною состояния. Спорообразующие бактерии мо­гут храниться годами в стерильной сухой почве или соответст­вующей среде.

Питательные среды. С. Я. Виноградским в практику микробиологии были введены элективные, или избирательные, среды, пред­назначенные для определенных групп микроорганизмов. Они составлены в расчете на предельно строгие условия, при кото­рых должен развиваться только избранный микроорганизм и никакой другой. Основной принцип элективных сред— учет избирательных потребностей микроорганизма в специфиче­ских условиях развития. Примером элективных сред могут служить среды для выделения азотфиксаторов, иитрификаторов. Эти среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их природного обитания и получения их накопительных культур.

Накопительные среды были предложены голландским ученым М. Бейеринком. В них интересующий исследователя компонент среды дается в избытке, чтобы выяснить, какой микроорганизм или группа микроорганизмов его использует, поскольку именно он или они будут доминировать в этой среде.

Оптимальные среды предложил А. А. Имшенецкий для целлюлозоразрушающих микроорганизмов, В. С. Буткевич - для продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger. Основной принцип оптимальных сред заключается в создании наиболее благоприятных условий для избранных микроорганизмов внесением в среду различных стимулирующих рост добавок (витаминов, ростовых веществ, микроэлементов).

По составу среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические. Естественнымиобычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Это — различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источ­ников. Их используют чаще в виде экстрактов или настоев. Hа естественных средах хорошо развиваются многие микроорга­низмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их био­массы и диагностических целей.

Синтетические — это такие среды, в состав которых вхо­дят в точно указанных концентрациях, только известные хими­чески чистые соединения. Синтетические среды бывают прос­тыми и достаточно сложными по составу. Их широко используют для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов. Существуют и так называемые полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределенным составом. В них наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Например, в мясной бульон наряду со сложными и неопределенными по химическому составу веществами (мясной бульон) могут входить пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия; картофельные среды содержат глюкозу и пептон. Полусинтетические среды широко используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Питательные среды могут быть различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие. Плотные питательные среды используют для учета количества бактерии, выделения чистой культуры и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5% агара или 10-15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят 0,1-0,2% агара. Агар — это растительный коллоид, получаемый из некоторыx морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды, а также ничтожное количество азотистых веществ. Выпускают агар в виде пластин, стебельков, порошка. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата, и поэтому агар удобен как инертный уплотнитель среды. Температура плавления агара — 100 °С, затвердения — 40 °С.

Желатина — кислый азотсодержащий продукт, добывае­мый при выварке костей, хрящей, сухожилий, чешуи рыб. Температура плавления желатины (22—25°С) ниже температу­ры инкубации большинства микроорганизмов (30—37°С). Эта особенность и способность многих микроорганизмов раз­жижать желатину, выделяя протеолитические ферменты, огра­ничивают ее применение в качестве уплотняющего средства.

Приготовление питательных сред. Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред используют мясной бульон, который получают следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалирован­ной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50 °С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1ч при 50—55 °С. Мясо отжимают, экстракт процежива­ют через марлю со слоем ваты, кипятят 30 мин для свертыва­ния коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз че­рез марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтрат доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закры­вают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Для приготовления МПБ к 1 л мясного бульона добавля­ют 5—10 г пептона (первый продукт гидролиза белка) для по­вышения калорийности среды и 5 г поваренной соли для созда­ния осмотической активности. Среду нагревают до растворе­ния пептона, постоянно помешивая.Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, приливая 20%-ный раствор Na₂CO₃ до посине­ния влажной красной лакмусовой бумажки. После установления рН среду снова кипятят 5—10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, от­фильтровывают через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Для этого свежий яичный белок вбивают с двойным по объему количеством воды и смешивают с охлажденным до 50°С бульоном. Смесь кипятят, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтруют. Прозрачный мясо- пептонный бульон разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляют 15— 20г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления - 100 °С , затвердевания— 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Nа₂,CO₃ и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара сголбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара — косяков). Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ). В 1 л МПБ помешают 100 — 150г желатины. Температура плавления желатины зави­сит от ее содержания в среде: в случае 10%-ной концентра­ции в среде она плавится при 24 °С; в случае 15%-ной — при 25 °С. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатины при осторожном нагрева­нии устанавливают слабощелочную реакцию среды (как для МПБ и МПА), кипятят 5 мин, затем охлаждают до 40—50 °С. Взбитый с небольшим количеством воды яичный белок влива­ют в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков в осадок становится прозрачной. Ее фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, разливают в пробирки и стерилизуют в ки­пятильнике Коха текучим паром, прогревая среду 3 раза по 30 мин каждые 24 ч.

Картофельный агар. Нарезают ломтиками 200 г очищен­ного и промытого водой картофеля, заливают 1 л водопровод­ной воды, варят 30 мин. Отвар фильтруют через вату и добавляют воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляют 2% агара, кипятят до его расплавления и устанавливают нейтральную реакцию среды (рН = 7). Среду стерилизуют 20 мин при 1 атм. По системе СИ давление принято выражать в паскалях (Па): атм = 1,01325 х10⁵Па = 0,1 МПа.

Пивное сусло и сусло-агар. Зерна ячменя замачивают в холодной воде и проращивают при 35 °С. После того как ростки станут вдвое длиннее зерен, последние высушивают до воздушно-сухого состояния, получая солод. Для приготовления сусла солод крупно размалывают и смешивают с водой (250 г солода на 1 л воды). Для лучшего выделения фермента амилазы смесь подогревают при 57 °С до исчезновения реакции на крахмал (синего окра­шивания с иодом). Сусло процеживают через вату, затем фильтруют через бу­мажный фильтр. Такое сусло содержит 10—20% сахара. Сусло разбавляют водой до концентрации сахара 6—8% и стерилизуют 30 мин при 115 °С и давлении 0,5 атм. Для приготовления сусло-агара к пивному суслу добавля­ют 2,5—3% агара, кипятят до расплавления, фильтруют через вату и стерилизуют при тех же условиях, как и пивное сусло.

Обезжиренное молоко. Для приготовления питательных сред используют снятое молоко, так называемый обрат, так как жир в молоке неблагоприятно влияет на рост некоторых мик­роорганизмов. Обрат получают сепарированием молока, нагре­того до 34 °С. Можно удалять жир и при отстаивании молока. При стерилизации следует помнить о том, что молоко нельзя длительное время выдерживать в автоклаве, так как лактоза (молочный сахар), содержащаяся в молоке, может ка­рамелизоваться. Обезжиренное молоко разливают в стерильные пробирки и выдерживают при 115 °С (давление 0,5 атм) 10 мин. После стерилизации его выдерживают 3 сут в термостате при 30 °С, чтобы спровоцировать развитие спорообразующих и других стойких к нагрева­нию форм. Через 3 сут пробирки с молоком просматривают и те, в которых развились микроорганизмы, выбраковывают. При длительной стерилизации на дно пробирки выпадает осадок казеина, который может частично пептонизироваться. Перегретое побуревшее молоко в качестве среды использовать нельзя.

Контрольные вопросы:

1. Что такое культивирование микроорганизмов?

2. Техника посева микроорганизмов на питательные среды.

3. Перечислите виды питательных сред?

4. С какой целью используют элективные среды?

5. Что такое собирательные среды?

6. Каким образом хранят микроорганизмы?

7. В чем различия между естественными и искусственными средами?