Определения физической выносливости животных

Тестирование безопасности наноматериалов на основе

6.8.1. Метод истощающего плавания

6.8.1.1. Принцип метода

Среди методик изучения физической выносливости организма при работе с животными

наиболее широко распространены методики истощающих физических нагрузок либо с помощью бега

на тредбане до отказа, либо в тестах истощающего острого плавания. Важно, что по сравнению с

методиками истощающего бега, методики истощающего плавания для сухопутных животных, к

которым относятся крысы, являются тестированием физической выносливости в условиях стресса,

т.е. в условиях, позволяющих максимально проявить незначительные нарушения функционирования

органов и систем (стрессорные и гипоксические воздействия различной природы, при нарушениях

функционирования ЦНС и в других случаях). Именно поэтому для оценки действия малотоксичных

или инертных препаратов, к которым можно отнести и значительное количество наноматериалов,

был выбран способ тестирования физической выносливости с помощью методики истощающего

плавания.

Высокая чувствительность, воспроизводимость и относительная простота исполнения методики

"истощающего плавания" при измерении выносливости организма являются основой введения ее в

комплекс методик физиологического скрининга для оценки влияния наноматериалов на жизненно

важные системы организма.

6.8.1.2. Животные, оборудование и материалы

6.8.1.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-

Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования

линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.

В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде

(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.8.1.2.2. Оборудование

Ведро эмалированное по ГОСТ 10503-71. Гири по ГОСТ 7328-2001. Компьютер IBM PC-

совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным обеспечением SPSS 12 (SPSS Inc.,

США) или с аналогичными параметрами.

6.8.1.3. Метод введения наноматериалов животным

Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно,

внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Используют острое (однократное введение), подострое (ежедневное введение в течение 3 месяцев) и

хроническое введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев) наноматериала.

Тест проводят сначала в режиме экспозиции, т.е. через 1 час

после

введения наноматериала, а затем каждый день в течение 14 дней (при

остром

введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни (при хроническом

введении).

Дозы введения наноматериала при остром воздействии - от

минимальной

токсической дозы до 1 LD , при подостром воздействии - от

минимальной

токсической дозы до 1/5 LD , при хроническом воздействии - 1/3

- 1/10

части минимальной токсической дозы.

6.8.1.4. Проведение измерений

Животное помещают в ведро с водой и следят за тем, чтобы оно не могло уцепиться за стенки

или выступы ведра. Добиваются того, чтобы животное находилось в состоянии активного плавания

постоянно. Тест продолжается вплоть до момента истощения, который выражается в том, что

животное начинает тонуть.

Для усиления стрессорной составляющей истощающего плавания и для стандартизации

методики, часто применяют плавание с грузом, составляющим 3 - 7% от массы тела животного.

Поэтому немаловажным стандартным параметром проведения методики является фиксирование веса

животных на протяжении всего эксперимента, особенно при хроническом способе введения

наночастиц. Известно, что при многократных, пролонгированных введениях даже малотоксичных

препаратов снижение веса тела является часто встречаемым ответом. Кроме того, снижение этого

параметра может быть опосредованным, т.е. регистрируемое снижение веса может быть вызвано не

самим препаратом, а способом его введения или вызванным и развившимся впоследствии

хроническим стрессом, как показано на множестве подобных моделей.

В ходе теста оценивают ряд параметров: время непрерывного плавания до момента истощения,

скорость движений передними и задними лапами, расстояние, проплываемое животным за единицу

времени, количество касаний стенки ведра.

6.8.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.

Расчет

LD , минимальной токсической дозы производят при предварительной

оценке

острой токсичности наноматериала согласно МУ 1.2.2520-09

"Токсиколого-

гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если основные параметры

(время непрерывного плавания до момента истощения, скорость движений передними и задними

лапами, расстояние, проплываемое животным за единицу времени, количество касаний стенки

ведра) у животных из опытной группы не отличаются достоверно от контроля.

6.8.2. Методика динамометрического измерения произвольной силы скелетных мышц передних

конечностей

6.8.2.1. Принцип метода

Методика динамометрического измерения произвольной силы скелетных мышц была

разработана для тестирования эффектов повреждающих токсических воздействий и обеспечивает

комплексную оценку нейромоторной функции. Этим обусловлена его информативность при

тестировании изменений физической работоспособности вследствие токсического воздействия

наноматериалов.

Методика основана на безусловной реакции животных цепляться за единственно доступную

опору и удерживаться на ней с максимальным усилием. С помощью данного теста можно объективно

оценивать произвольное усилие, которое способны развивать животные. Методика входит в

перечень методов, рекомендуемых национальной токсикологической программой США для оценки

нейротропных эффектов различных повреждающих воздействий ("The neurobehavioral test battery").

Под влиянием психотропных препаратов (фенобарбитала и хлордиазепоксида - соединения

диазепинового ряда) наблюдается заметное снижение силы мышц передних конечностей, что

свидетельствует о том, что данная методика является перспективным подходом для оценки

нейромоторных эффектов психотропных фармакологических агентов, а также нейротропных

воздействий окружающей среды.

Величина регистрируемой произвольной силы зависит от многих факторов. Величина

развиваемого усилия зависит от функционирования центральных механизмов управления

движением, в том числе, структур головного мозга, ответственных за формирование центральной

управляющей команды. Наконец, она зависит от состояния периферического нервно-мышечного

аппарата.

Кроме того, величина регистрируемого этим методом параметра зависит от функциональных

характеристик органа-исполнителя - скелетной мышцы. Так, уменьшение массы тела вследствие

частичной пищевой депривации сопровождается выраженным снижением произвольной силы

мышц.

6.8.2.2. Животные, оборудование и материалы

6.8.2.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-

Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования

линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.

В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде

(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.8.2.2.2. Оборудование

Система динамометрического измерения силы GripStrength Meter (TSE Instuments, Германия).

Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным обеспечением

SPSS 12 (SPSS Inc., США) или с аналогичными параметрами.

6.8.2.3. Метод введения наноматериалов животным

Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно,

внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).

Используют острое (однократное введение), подострое (ежедневное введение в течение 3 месяцев) и

хроническое введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев и более) наноматериала.

Тест проводят сначала в режиме экспозиции, т.е. через 1 час

после

введения наноматериала, а затем каждый день в течение 14 дней (при

остром

введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни и более (при

хроническом

введении). Дозы введения наноматериала при остром воздействии

- от

минимальной токсической дозы до 1 LD , при подостром

воздействии - от

минимальной токсической дозы до 1/5 LD , при хроническом

воздействии -

1/3 - 1/10 части минимальной токсической дозы.

6.8.2.4. Проведение измерений

Тестирование физической силы мышц проводится с использованием системы

динамометрического измерения силы GripStrength Meter. Во время тестирования животное помещают

в установку и, держа его за хвост, дают ухватиться за рычаг, соединенный с тензометрическим

датчиком. Равномерным движением крысу тянут за хвост и регистрируют максимальное значение

силы в момент отрыва от рычага.

6.8.2.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.

Расчет

LD , минимальной токсической дозы производят при предварительной

оценке

острой токсичности наноматериала согласно МУ 1.2.2520-09

"Токсиколого-

гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если максимальное

значение силы в момент отрыва у животных из опытной группы не отличается достоверно от

контроля.

Приложение 1

(справочное)

НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

2.1. Федеральный закон Российской Федерации от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-

эпидемиологическом благополучии населения".

2.2. Федеральный закон Российской Федерации от 2 января 2000 г. N 29-ФЗ "О качестве и

безопасности пищевых продуктов".

2.3. Закон Российской Федерации от 26 июня 2008 г. N 102-ФЗ "Об обеспечении единства

измерений".

2.4. Федеральный закон Российской Федерации от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом

регулировании".

2.5. Федеральный закон Российской Федерации от 10 января 2002 г. N 7-ФЗ "Об охране

окружающей среды".

2.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 987 "О

государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых

продуктов".

2.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 г. N 988 "О

государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий".

2.8. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23

июля 2007 г. N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и

содержащих наноматериалы".

2.9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31

октября 2007 г. N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии

оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов".

2.10. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

2.11. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 г. N 755 "О мерах по

дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием

экспериментальных животных".

2.12. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19 июня 2003 г. N 267

"Об утверждении Правил лабораторной практики" (Зарегистрирован Минюстом России 25.06.2003 N

4809).

2.13. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека от 19 июля 2007 г. N 224 "О санитарно-эпидемиологических экспертизах,

обследованиях, исследованиях, испытаниях и токсикологических, гигиенических и иных видах

оценок" (Зарегистрирован Минюстом России 20.07.2007 N 9866).

2.14. Межотраслевые правила по охране труда при использовании химических веществ. ПОТ Р

М-004-97. Утверждены Министерством труда и социального развития Российской Федерации,

Постановление от 17 сентября 1997 г. N 44. Согласованы с Федерацией независимых профсоюзов

России, письмо от 9 января 1997 г. N 109/5. Введены в действие с 1 апреля 1998 г.

2.15. СП 2.2.2.1327-03. "Гигиенические требования к организации технологических процессов,

производственному оборудованию и рабочему инструменту". - Утверждены Главным

государственным санитарным врачом Российской Федерации, первым заместителем Министра

здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 23 мая 2003 г. Дата введения: 25 июня 2003

г. М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. - 52 с.

2.16. Гигиенические нормативы "Предельно допустимые количества химических веществ,

выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми продуктами" ГН 2.3.3.972-00 (Утв.

постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации, 2000 г.).

2.17. СанПиН 2.1.7.1322-03 "Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию

отходов производства и потребления".

2.18. "Методические рекомендации по организации хранения, учета и применения химических

реактивов в лабораториях санэпидстанций", N 2674-83, Минздрав СССР.

2.19. СанПиН 2.6.1.2523-09 "Нормы радиационной безопасности (НРБ-99/2009)", утвержденные

Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 07.07.2009 N

47.

5rik.ru

Материалы для учебы и работы

Определения физической выносливости животных