Інші вектори (помірні фаги та косміди).
Ті-плазміда Agrobacterium tumefaciens та її Т-ДНК.
Одним із векторів є крупна кон’югативна плазміда патогенної бактерії Agrobacterium tumefaciens. Плазміда відповідальна за індукцію пухлин у дводольних. В тканинах рослин, в які проживає ця плазміда синтезується значна кількість ауксинів і цитокінінів і в культурі in vitro вони зовсім не потребують додавання цих гормонів.
Молекулярно-генетичні дослідження цієї бактерії і її плазміди розпочалося в 1976 р. в інституті ім. Макса Планка в Кельні (ФРГ). Ці плазміди були названі Ті-плазмідами. Особливий фрагмент (ділянка) Ті-плазміди, названий Т-ДНК може інтегруватися в геномом рослини (спочатку це виявили на пухлинах тютюну). Протопласти тютюну були трансформовані Ті-плазмідою A. tumefaciens.
Отже, утворення пухлин в тканинах рослин, що викл. Ті-плазмідою A. tumefaciens індукується перенесенням ділянки бактерії т-ДНК (з прокаріот. клітини) і її інтеграцією в геном еукаріотичної клітини.
Т-ДНК містить 7 генів.
В 1981 р. Кемпу і Холлу (США) вдалося за допомогою Ті-плазмід перенести ген, що кодує у бобових білок фазеолін (розповісти) в рослини соняшника.
Другий метод, яким користуються дослідники для введення гена в бактеріальні клітини базується на використанні бактеріофага як вектора. Ген вбудовують в геном помірного фага, який містить 10-50 генів, і він реплікується разом з генами фага в бактеріальній клітині.
Для одержання рекомбінантних молекул з великими розмірами вставок (до 23 тис. п.н.) (в плазміду можна вбудувати лише вставку до 15 тис. п.н.) як вектор використовують ДНК λ-фага.
Вона має два сайти для дії рестриктази РІ. Кінцеві ділянки, які відрізуються нею, містять інформацію для розмноження фага. Середню частину ДНК λ-фага вирізають і на її місце вставляють фрагмент чужої ДНК, об’єднують її з кінцевими ділянками фагової ДНК. Зшивання фрагментів здійснює лігаза. Рекомбінантна молекула упаковується в білкову оболонку і утворюється зріла фагова частка здатна до розмноження.
Лекція №5,6 (4 год)
План:
1. Статева гібридизація та бар’єри на шляху віддаленої гібридизації.
2. Культура ізольованих клітин і тканин. Голі протопласти як об’єкти для перенесення генів.
3. Тотіпотентність рослинних клітин. Тотіпотентність тваринних клітин раннього зародку.
4. Соматична гібридизація.її значення для науки і практики. Поліетиленгліколь як універсальний індуктор злиття клітин.
5. Гібридоми.
6. Клонування: а) рослини;
б) тванини;
в) проблеми і морально-етичні аспекти можливого клонування людини.
7. Стовбурові клітини та їх значення для медицини.
1. Статева гібридизація та бар’єри на шляху віддаленої гібридизації.
Схрещування організмів, які належать до різних видів і родів, називають віддаленою гібридизацією. Цей метод застосовують тоді, коли шляхом міжсортової гібридизації не вдається вирішити певних завдань, які стоять перед селекціонером. Так, під час селекційної роботи з картоплею значна увага надається стійкості. Однак усі сорти картоплі, які належать до культурного виду Solarium tuberosutn, пошкоджуються фітофторою, раком та вірусними хворобами. Серед них немає стійких форм, які кожна було б використати як компоненти для схрещувань. Важливо, що деякі дикі і примітивні види виявляються стійкими до цих захворювань, мають дуже високий (до 6 %) вміст білка, можуть витримувати заморозки до 5—6 °С, не пошкоджуються колорадським жуком та нематодою.
Досвід селекції свідчить, що корисні ознаки диких форм можна передати шляхом віддалених схрещувань іншим видам і навіть родам, а точніше — віддаленим гібридам. Покращення сортів певного виду відбувається за рахунок передачі їм окремих господарче цінних ознак. Процес, унаслідок якого незначна кількість генетичного матеріалу одного виду передається іншому, називають інтрогресією. Він базується на повторних зворотних схрещуваннях гібридних потомств з культурним видом, що і забезпечує його таксономічну цілісність.
Розщеплення в потомстві віддалених гібридів характеризується різноманітністю і бурхливим формотворчим процесом. Однак характер і амплітуда спадкової мінливості залежать від спорідненості форм, кількості хромосом та їхньої структури. Генетичної збалансованості і стабільності гібридних організмів вдається досягти лише в пізніших поколіннях.
Всю різноманітність віддалених схрещувань можна поділити на три групи.
1. Схрещування генетичнj близьких видів однаковим числом хромосом. Такі схрещування вдаються, мейоз протікає нормально, і гібриди виявляються фертильними, якщо хромосоми частково або цілком гомологічні.
2. Схрещування видів одного роду, які відрізняються за геномним складом. При цьому можуть виникати різні проблеми, на яких ми зупинимося далі.
3. Міжродова гібридизація характеризується тим, що генетичні, біохімічні, фізіологічні, цитологічні і морфологічні відмінності між компонентами схрещувань дуже великі. Внаслідок цього виникають значні ускладнення, для подолання яких застосовують спеціальні прийоми.
Використовуючи метод віддаленої гібридизації, селекціонер стикається з такими ускладненнями: 1) несхрещуваність видів; 2) нежиттєздатність гібридного насіння; 3) стерильність гібридів.