Плазміди як основні вектори, що використовуються в генній інженерії.

Поняття вектора і його роль в генетичній інженерії (трансгенозисі).

Штучно створені гени та фрагменти ДНК при введенні їх в клітину не мажуть самостійно відтворюватись і передаватися потомству. Для подолання цієї перешкоди їх включають до складу генетичної структури, яка здатна до реплікації. Така структура, яка становить собою окремий реплікон і використовується для перенесення генетичного матеріалу, носить назву вектора, або перенощика. Вектор — це молекула ДНК, яка здатна переносити в клітину чужий ген і забезпечувати там його розмноження (реплікацію). Вектор може реплікуватися або автономно, або після його інтеграції з геномом.

На початку 1950 років плазміди відкрив Ледерберг (пригадаймо кон’югацію у бактерій і його досліди з множинними ауксотрофами). Він виявив, що крім основної ДНК (яку зрозуміло чому називають хромосомою), бактерії містять ще й маленькі молекули ДНК, які він назвав плазмідами (П), якими бактеріальні клітини охоче обмінюються під час кон’югації.

Спочатку відкриття плазмід не викликало особливого інтересу. Про плазміди заговорили медики в 1959 р., коли японські дослідники виявили, що неефективність найкращих на той час антибіотиків при лікуванні дизентерії у багатьох хворих, зумовлена тим, що бактерії, якими заражені ці пацієнти, мають у своїх клітинах плазміди, що містять кілька генів стійкості до різних антибіотиків. Пізніше з’ясували що майже завжди гени стійкості до антибіотиків містяться у плазмідах. Здатність переходити з однієї бактерії до іншої (під час кон’югації) призводить до того, що П., що містять такі гени, швидко поширюються серед бактерій як тільки починаються застосування того чи іншого антибіотика. За кілька годин сумісноо культивування нестійкий штам бактерій «запозичує» від свого стійкого співмешканця виняткову стійкість і стає зовсім нечутливим .

Стафілококкова інфекція, що є проблемою хірургічних клінік, зобов’язана своєю диявольською стійкістю до антибіотиків, також плазмідам.

R- плазміди, на відміну від F- фактора, ніколи не вбудовуються у хромосому.

П. поза клітиною – це просто молекула ДНК, а в клітині вони розмножуються разом з клітиною-господарем. Мати пладміди для клітини «накладно», бо їх треба «годувати», як собаку (витрачати матеріал і Е для їх реплікації). Але в екстримальних умовах, у ворожому оточенні, вони, як пес, захищають клітину від сильнодіючих агентів (антибіотиків, солей важких металів, анфтового забруднення тощо). П. керують синтезом ісектициду (білка) в клітинах Bacillus thuringiensis.

Співіснування плазмід і бактеріальних клітин є взаємовигідним союзом, немовби симбіозом.

Трансмісивність П., що завдала клопоту лікарям, виявилася доречною для ГІ, бо завдяки простоті своєї будови П. виявилися зручними структурами, в які «вбудовуються» чужі гени і клонують (розмножують) їх у бактеріальних клітинах.

Розроблено методи завдяки яким можна примусити клітину мати не 1-2, а тисячі копій плазміди (рек ДНК). Завдяки використанню цих методів можна домогтися фантастичної продуктивності по синтезу білка, закодованого вмонтованим геном.

Векторами в генній інженерії служать плазміди, фаги та косміди. Плазміди бактерій — це позахромосомні молекули ДНК кільцевої форми розміром від 2 до 400 тис. пар нуклеотидів. Характерною їх особливістю єтрансмісивн і с т ь, тобто здатність передаватися від одних бактеріальних клітин до інших. Перенесення плазмід відбувається в природі і в експерименті. Існує два типи плазмід — однокопійні (на клітину припадає 1 молекула плазмідної ДНК) і мультикопійні (на одну клітину припадає 10—20 плазмідних геномів). Окремі плазміди, які знаходяться під послабленим контролем реплікації, можуть накопичуватися (за умов припинення росту бактерій) у величезних кількостях — до 1 тис. плазмід на одну клітину. Такі плазміди використовуються для клонування векторів, оскільки вони забезпечують високий вихід матеріалу.

Останні двадцять років інтенсивно вивчаються і використовуються плазміди, які зумовлюють стійкість бактерій до антибіотиків (R-плазміди; resistance — стійкість). Вони містять генетичну інформацію, що забезпечує синтез продуктів, які подавляють дію антибіотиків.

На рис. 101 зображено плазміду з генами стійкості до ампіциліну і тетрацикліну (Атр^r; Tef^r). Всередині цих генів є ділянки дії рестриктаз. Плазміда, точніше ген стійкості до антибіотика, розрізується рестриктазою, і в місці розрізу за допомогою ферментів вмонтовується чужа ДНК, нарізана на фрагменти цією самою рестриктазою. Розрізаний ген при цьому пошкоджується, і бактерія з рекомбінантною плазмідою втрачає стійкість до антибіотика. Зверніть увагу на те, що рестриктази розщеплюють ДНК у тих ділянках, де комплементарні нуклеотиди розміщуються відповідно до осьової симетрії. Місця розщеплення молекули даною рестриктазою вказані пунктирними стрілками. Внаслідок розщеплення утворюються фрагменти з липкими кінцями (ТТАА; ААТТ). Фрагменти різного походження, одержані під впливом однієї рестриктази, мають комплементарні липкі кінці і легко зшиваються між собою в кільцеву структуру. Поряд з плазмідною ДНК вона містить ДНК донора. Найчастіше для створення рекомбінантних гібридних молекул використовують плазміди, які мають лише одну ділянку дії для певної рестриктази, тобто ДНК розрізується нею в одному місці. У плазміду можна вставити фрагмент чужої ДНК розміром не більше 15 тис. пар нуклеотидів. З цією метою розрізані певною рестриктазою плазміди і фрагменти ДНК донора змішуються і під дією лігази зшиваються у кільцеву структуру — гібридну плазміду (рекомбінантну ДНК).

Рекомбінантні молекули так само, як і вихідні плазміди, під час введення їх у клітину реплікуються і передаються дочірнім клітинам. Внаслідок трансформації реципієнтні клітини набувають певних ознак донора.