Репликация ДНК
Общие принципы реакций
Все биополимеры (полипептиды, гетерополисахариды, полинуклеотиды) имеют организацию, - специфическую упаковку в пространстве, поэтому их синтез включает дополнительно и стадию структурирования. А если их звенья еще и отличаются друг от друга, отсюда, чтобы вновь образующийся полимер включал их в строго определенном порядке, необходима матрица, что и отличает генез белков и нуклеиновых кислот от других подобных процессов. Кроме того, любой синтез требует затрат энергии, причем часто в этих случаях используются не обычные макроэрги, а происходит с их помощью предварительная активация субстратов. Исходя из этих предпосылок, можно выделить следующие общие принципы, характерные для этих процессов:
1) Наличие матрицы: в синтезе дочерней ДНК ею служит вся материнская ДНК; для образования РНК используется фрагмент ДНК (ген, или транскриптон); аминокислотная последовательность определяется набором триплетов иРНК.
2) Субстраты предварительно активируются: на первой стадии используются дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, ТТФ), генез РНК требует наличия соответственно АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, полипептиды получаются из аминоацил-тРНК.
3) Основные ферменты, обеспечивающие собственно полимеризацию, относятся к классу трансфераз и называются ДНК-, РНК-полимеразы и пептидилтрансфераза.
4) Сложность образования биополимера выделять в этом процессе две фазы: собственно синтез (как бы начерно) и созревание – укладку в пространстве, химическую модификацию.
5) В собственно синтезе выделяют следующие стадии: а) инициацию – начало; б) элонгацию (longus - длинный) – наращивание цепи; в) терминацию – остановку реакций.
Репликация – синтез дочерней ДНК с использованием в качестве матрицы всей молекулы материнской ДНК. С этого процесса и начинается деление клетки в S-фазу (синтетическую). В основе репликации лежат три принципа: а) комплементарности – азотистые основания образующейся дочерней цепи должны обладать химическим и геометрическим соответствием с подобными веществами материнской нити; полуконсервативности – каждая из синтезированных молекул ДНК состоит из одной материнской и одной дочерней; в) однонаправленности – считывание матрицы идет от 5' к 3' концу.
Чтобы порядок азотистых оснований, находящихся внутри нитей ДНК, можно было считывать, необходимо разорвать водородные связи, соединяющие между собой цепи и лишить их спирализации. Для этих целей используются следующие ферменты: топоизомераза и хеликаза. Первая гидролизует на одном из участков полинуклеотида фосфодиэфирная связь, что позволяет этому фрагменту раскрутиться относительно параллельно лежащего:
а затем восстановить связь. Хеликаза разрушает водородные взаимодействия между противолежащими основаниями участков двух цепей:
Под ее действием фрагменты расходятся, образуя репликативную вилку. Затем с помощью праймазы (primer - затравка) синтезируется олигорибонуклеотид – небольшое соединение, состоящее (обратите внимание) из 8-10 монорибонуклеотидов. Оно служит местом, куда крепится основной фермент – ДНК-полимераза. Из-за антипараллельности цепей данные структуры будут локализоваться в разных местах: одна у конца, другая несколько в глубине противоположной нити:
Все дело в том, что ДНК-полимеразы не могут начинать синтез, а способны только добавлять дезоксирибонуклеотидные звенья к 3'-концу уже имеющейся цепи, чем и является праймер. Описано 3 класса данных энзимов: в ядрах присутствуют полимеразы альфа (Роl α), ответственные за хромосомную репликацию, полимеразы бета (Роl β), которые используются при необходимости при репарации. Третий их представитель – ДНК-полимераза гамма (Роl γ) осуществляет синтез кольцевого генома митохондрий.
Присоединение каждого нового нуклеотидного остатка к 3'-концу растущей цепи сопровождается гидролизом макроэргической связи в дНТФ и отщеплением пирофосфата.
Важная деталь – генетический материал живых организмов имеет огромные размеры, но реплицируется с высокой точностью. В среднем при воспроизведении генома (ДНК длиной более 3 млрд пар нуклеотидов) возникает не более 3-х ошибок благодаря наличию специальных механизмов, осуществляющих необходимую коррекцию. Суть последней в том, что ДНК-полимеразы дважды проверяют соответствие каждого нуклеотида матрице: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй – перед присоединением нового нуклеотида. Очередная фосфодиэфирная связь синтезируется лишь в том случае, если последний мономер удлиняющейся дочерней нити ДНК образовал правильную (комплементарную) пару с соответствующим нуклеотидом матрицы. Если же на предыдущей стадии произошло ошибочное спаривание оснований, то фермент возвращает последнее добавленное звено, после чего освободившееся место занимает правильный нуклеотид.
Параллельно с ростом цепи продолжается деспирализация и разделение цепей с помощью топоизомеразы и хеликазы, удлинение репликативной вилки. А так как процесс осуществляется лишь в одном (5' – 3') направлении, что позволяет происходить этому явлению непрерывно только на одной из матричных нитей. На антипараллельной синтез ограничивается сравнительно короткими фрагментами (100-1000 мононуклеотидов), названными по имени обнаружившего их ученого фрагментами Оказаки (с постоянным предварительным синтезом праймеров):
Так продолжается до тех пор, пока вся матрица не выполнит свою функцию, причем во время репликации специальные нуклеазы вычленяют праймеры. Если позволяет направление, ДНК-полимеразы застраивают возникшие бреши, а сшивание сближенных фрагментов обеспечивается ДНК-лигазами – так завершается собственно синтез (стадия терминации).
В тех концах дочерних цепей, где находились праймеры, которые позднее были удалены, не происходит достраивания дезоксирибонуклеотидами (невозможно считывание в обратном направлении), отсюда при каждом делении клетки молекулы новых цепей укорачиваются на 10-20 нуклеотидов, но объем информации при этом не уменьшается, так как потерянные участки ее не несли. Дело в том, что когда в эмбриональных тканях шли усиленные митозы параллельно с этим осуществлялись обратные транскрипции. С помощью теломеразы концы ДНК наращивались теломерными повторами ТТАGGG, роль матрицы при этом выполняла РНК, включающая 450 мононуклеотидов. Поскольку многократно повторенные теломерные последовательности не являются кодирующими, их утрата в процессе деления не приводит к потере информативных участков, тем самым обеспечивается передача генетического материала в поколениях клеток.
Однако в родившемся организме активность теломераз регистрируется лишь в половых, раковых, стволовых клетках, в соматических же эти ферменты не работают. Теломеры постепенно укорачиваются, что в конце концов запускает процессы остановки клеточного цикла и провоцирует апоптоз. Интересный факт: ученые, исследующие рак, до сих пор используют культуру клеток Неlа из опухоли женщины по имени Генриетта Лакс. Эта больная умерла в 1951 году, но клетки ее новообразования продолжают делиться и собираются жить вечно.
Происходящее в момент деления клетки удлинение синтезирующихся нитей ДНК сопровождается их созреванием, что включает спирализацию, суперспирализацию (закручивание цепей вокруг гистоновых нуклеосом), химическую модификацию (гидроксилирование, метилирование, гидрирование азотистых оснований) с образованием минорных оснований, соединение с помощью ионных связей с белками, катионами металлов (К+, Са++, Мg++, Мn++, Fе++, Сu++ и т.д.), которые стабилизируют или, наоборот, дестабилизируют вновь синтезированную молекулу.