Реакция локального гемолиза в геле
Дополнительный материал к занятию
План изучения темы
Исходный уровень знаний
ЗАНЯТИЕ 16
РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА (ИММУННОГО БАКТЕРИОЛИЗА,
ИММУННОГО ГЕМОЛИЗА). РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ
КОМПЛЕМЕНТА. РЕАКЦИИ С МЕЧЕНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ:
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ (РИФ), ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ
АНАЛИЗ (ИФА), ИММУНОБЛОТТИНГ, РАДИОИММУННЫЙ
АНАЛИЗ (РИА), ИММУННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ (ИЭМ)
На данном занятии изучаются реакции иммунитета с участием комплемента и реакции иммунитета с мечеными компонентами (меченые антигены или антитела). Необходимо продумать механизмы и схемы постановки этих реакций. В последние годы перечисленные реакции широко используются для диагностики инфекционных заболеваний и вытесняют традиционные методы (агглютинации, преципитации).
Цель самоподготовки
После самостоятельного изучения темы студент должен знать о каждой из реакций:
- ингредиенты;
- механизм реакции;
- методы и схемы постановки;
- практическое применение;
- диагностические препараты.
Для усвоения материала необходимо восстановить знания, полученные на предыдущих двух занятиях: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета.
Цель занятия
1. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза.
2. Изучить механизм и методы постановки реакции связывания комплемента (РСК).
3. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ).
4. Изучить механизм и методы постановки реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга.
5. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ).
6. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований.
1. Реакция иммунного бактериолиза.
2. Реакция иммунного гемолиза.
3. Реакция связывания комплемента.
4. Реакция с мечеными компонентами: РИФ, ИФА, РИА. ИЭМ, иммуноблоттинг.
5. Реакции иммобилизации.
После изучения темы студент должен уметь
1. Поставить РСК с готовыми ингредиентами по схеме, учесть и интерпретировать её результат.
2. Учесть и оценить результаты РИФ.
3. Учесть и оценить результаты ИФА.
4. Учесть и оценить результаты иммуноблоттинга.
Реакция предложена Н. Йерне в 1963 г., её применяют для подсчета клеток-антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезёнки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, так как даёт возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и органов и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
ИФА –это выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, β-галактозидазой или щелочной фосфатазой).
Наиболее распространён твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твёрдом носителе, например, в лунках пластиковой микропланшетки из полистирола. Для определения антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют:
- сыворотку крови больного,
- антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом,
- смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.
Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путём тщательного промывания. При положительном результате изменяется окраска раствора хромогена в жёлто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы).
Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.
Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов.
К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА.
Конкурентные методы ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот тест используется для определения количества антигена в исследуемом материале.
Сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена):фиксированные на твёрдой фазе антитела инкубируют с анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител, специфичных к тому же антигену. Несвязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Можно использовать немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов.
Измерение количества продуктов реакции ИФА проводят в автоматизированном варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра, по оптической плотности растворов в лунках при определённой длине волны.