Техника ПЦР

Исследуемым материалом для ПЦР может быть культура бактерий, нуклеиновые кислоты, выделенные из клеток, биологические жидкости (кровь, моча), материал из внешней среды – вода, почва, пищевые продукты и т.д., содержащие ДНК или РНК.

На I этапе молекула ДНК разделяется нагреванием до 95⁰С на 2 комплементарные нити.

На II этапев реакционную смесь добавляют искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотидные праймеры двух типов. Одни из них комплементарны началу одной цепи ДНК, другие – концу второй. Одновременно вводится смесь 4 типов ddNTP. Праймеры соединяются с цепями ДНК.

На III этапе смесь нагревают до 70⁰С и добавляют фермент ДНК-полимеразу (термостабильную), выделенную в 1980 году Калединым из бактерий Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках. Этот фермент достраивает вслед за каждым праймером вторую цепь. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз до получения миллиона копий исходной молекулы ДНК. Для проведения ПЦР применяются специальные термостаты – термальные циклеры, позволяющие многократно и быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб.

На IV этапе проводится оценка результатов ПЦР с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, ярко светящимся в ультрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы затем анализируются.

ПЦР наиболее эффективна для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях. Как правило, эти возбудители – внутриклеточные паразиты, длительно персистирующие в организме хозяина.

Контрольные вопросы

Дайте определение понятий «наследственность» и «изменчивость». Основные этапы развития учения о наследственности и изменчивости у микроорганизмов. Что такое генотип, фенотип? Особенности структуры генома прокариотов. Структурная модель ДНК по Уотсону и Крику. Что такое генетический код? Какими символами обозначается генотип и фенотип бактерий? Перечислите внехромосомные факторы наследственности. Перечислите бактериальные плазмиды; какие свойства они кодируют? Что такое трансмиссивные, нетрансмиссивные плазмиды? Что такое транспозоны, Is-последовательности? Формы изменчивости микроорганизмов: генотипическая и фенотипическая. Механизмы наследственной изменчивости бактерий: мутации и рекомбинации, виды рекомбинаций. Укажите фамилию учёного, опыты которого с пневмококками наметили пути для поиска материальной основы наследственности. Опишите механизм трансформации, трансдукции, конъюгации. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.

ЗАДАЧА. У больного К. с диагнозом бактериальная дизентерия в первый день заболевания выделен возбудитель дизентерии с типичными для этого вида биохимическими и другими свойствами (не ферментировал лактозу). Через два дня у этого же больного был выделен микроб, у которого все свойства были типичными для возбудителя дизентерии: у него появилась способность ферментировать лактозу. Какой генетический механизм возникновения у возбудителя дизентерии нового свойства можно предположить? Как доказать наличие предполагаемого вами механизма изменчивости?

Дайте определение понятий: молекулярная биология, биотехнология, генетическая инженерия. Опишите последовательность этапов генной инженерии. Укажите способы получения чистых генов для генетической инженерии; векторы (проводники) с помощью которых рекомбинантную ДНК можно ввести в клетку. Ферменты, с помощью которых можно расщеплять молекулу ДНК на отдельные фрагменты, «сшивать» отдельные фрагменты ДНК. Достижения генетической инженерии и биотехнологии: перечислите основные продукты, применяемые в медицине. Геномная инженерия: методы, достижения. Значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки

Составьте схему: «Формы изменчивости бактерий».

Работа студента на практическом занятии

1. Учёт посевов предыдущего занятия (см. занятие 11).

2. Опыт по выявлению спонтанных мутаций у бактерий.

Цель опыта: определить, имеются ли мутанты, устойчивые к стрептомицину, в культуре бактерий, которая не соприкасалась со стрептомицином.

Методика: на чашке с МПА производится рассев культуры бактерий с целью получения изолированных колоний. После суточного инкубирования в термостате выросшие колонии с помощью игольчатого штампа-репликатора переносятся на чашку с МПА, содержащим стрептомицин, и контрольную чашку. После суточного инкубирования в термостате учитывают результат.

Результат: зарисовать чашки с колониями.

Вывод: сформулировать.

3. Опыт конъюгации бактерий.

Цель опыта: определить, возможна ли конъюгация между данными штаммами.

ЗАДАЧА: получить прототрофный рекомбинант путём конъюгации двух ауксотрофных культур.

Материал: донор, ауксотроф по лейцину, реципиент - ауксотроф по треонину.

Методика: суточные бульонные культуры этих штаммов смешивают во флаконе и оставляют в термостате на 30-60 минут. В результате конъюгации от клеток донора к реципиенту передаются гены, кодирующие способность синтезировать треонин, и образуются прототрофные клетки. Для выявления этих клеток смесь бактерий высевают на среду, в которой отсутствуют лейцин и треонин (так называемая минимальная среда). Если конъюгация произошла, то на минимальной среде вырастут колонии прототрофных рекомбинантов. Донор и реципиент не вырастают.

Результат: нарисовать чашку с готовым результатом опыта.

Вывод: сформулировать.

4. Нарисовать в тетради схемы опытов трансформации и трансдукции.

5. Опыт бактериоциногении.

Цель: определить, какие из испытуемых культур кишечной палочки способны продуцировать колицины.

Методика: испытуемые культуры засеяны бляшками на чашке с МПА. После двухсуточной инкубации в термостате выросшие культуры убиты парами хлороформа. На поверхность посева наливается растопленный МПА, содержащий колицинчувствительную культуру. После инкубации в термостате учитывается результат по зонам отсутствия роста вокруг колоний колициногенных культур.

Результат: зарисовать.

Вывод: сформулировать (указать колициногенные культуры).

6. Диссоциация бактерий. Посмотреть с помощью бинокулярной лупы колонии эпидермального стафилококка: гладкие (S) и шероховатые (R).

РАЗДЕЛ 4.