Направления молекулярной генетики.
Клонирование— метод получения нескольких генетически идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения.
Клонирование человека — этическая и научная проблема конца XX-го — начала XXI-го века, состоящая в технической возможности приступить к формированию и выращиванию принципиально новых человеческих существ, точно воспроизводящих не только внешне, но и на генетическом уровне того или иного индивида, ныне существующего или ранее существовавшего — вместе с полной этической неподготовленностью к этому обществу.
Цель клонирования: создание генотипической и фенотипической копии, полностью тождественной клонируемой.
Берется соматическая (не половая) клетка, предполагается, что она должна быть полным аналогом зиготы, из которой выросла данная особь. В принципе такую клетку не найти:
- Все клетки взрослого организма хотя и содержат диплоидный набор хромосом, но ее генетический состав не соответствует на 100% генетическому составу зиготы, т.к все клетки проходят дифференцировку. А дифференцировка предполагает преобразование генетического состава. Пример- эритробласт.
- Все клетки имеют шанс развития в них спонтанных мутаций, причем они не определены, т.е. она не изменяет ее жизнедеятельность. Если из этой клетки получить особь, тогда мутация отразится
- При клонировании берут ядро, а цитоплазма используется яйцеклетки другой особи, возникает вопрос цитоплазматической наследственности. Митохондрии имеют свою ДНК.
- Из многочисленных попыток клонирования млекопитающих лишь очень малый процент завершился рождением полноценной особи, хотя фенотипически эта особь не отличается от клонируемой. С точки зрения молекулярной биологии реальности этих программ нет
Препятствия клонированию:
- Технологические трудности и ограничения
- Социально-этический аспект
- Этико-религиозный аспект
- Отношение в обществе
- Биологическая безопасность
- Правовой аспект
20Генная инженерия (ее направления, технический алгоритм) и генная терапия. Векторы доставки генов. Основные направления генной инженерии и генной терапии. Генная терапия моногенных болезней.
Генетическая инженерия (генная инженерия) —совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.
Генная инженерия- это научное направление, цель которого, направленное преобразование определенных функций организма, при внесении организму заданных свойств или коррекции генетических аномалий. Ген. инженерия растений - направленная селекция. Ген. инженерия животных - генетическая терапия. Цель - у экспериментальных животных иногда имеет смысл внедрения гена для создания каких то заболеваний (трансгенные мыши).
Принципы:
1. замена гена (аномального) в какой-то клеточной популяции
2. замена гена на его здоровую копию во всех клетках особи(сложнее).
2 группы болезней:
- Моногенные заболевание обусловлено дефектом одного гена
- Полигенные - на развитие болезни оказывают влияние несколько разных генов.
Вероятность развития - предрасположенность
Основные этапы решения генно-инженерной задачи следующие:
1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для переноса в организм.
3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм.
4. Преобразование клеток организма.
5. Отбор генетически модифицированных организмов (ГМО) и устранение тех, которые не были успешно модифицированы.
Процесс синтеза генов в настоящее время разработан очень хорошо и даже в значительной степени автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых закладывают программы синтеза различных нуклеотидных последовательностей. Такой аппарат синтезирует отрезки ДНК длиной до 100—120 азотистых оснований (олигонуклеотиды). Получила распространение техника, позволяющая использовать для синтеза ДНК, в том числе мутантной, полимеразную цепную реакцию. Термостабильный фермент, ДНК-полимераза, используется в ней для матричного синтеза ДНК, в качестве затравки которого применяют искусственно синтезированные кусочки нуклеиновой кислоты — олигонуклеотиды. Фермент обратная транскриптаза позволяет с использованием таких затравок (праймеров) синтезировать ДНК на матрице выделенной из клеток РНК. Синтезированная таким способом ДНК называется комплементарной (РНК) или кДНК. Изолированный, «химически чистый» ген может быть также получен из фаговой библиотеки. Так называется препарат бактериофага, в геном которого встроены случайные фрагменты из генома или кДНК, воспроизводимые фагом вместе со всей своей ДНК.
Чтобы встроить ген в вектор, используют ферменты — рестриктазы и лигазы, также являющиеся полезным инструментом генной инженерии. С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в вектор. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит также были удостоены Нобелевской премии (1978 г.).
Техника введения генов в бактерии была разработана после того, как Фредерик Гриффитс открыл явление бактериальной трансформации. В основе этого явления лежит примитивный половой процесс, который у бактерий сопровождается обменом небольшими фрагментами нехромосомной ДНК, плазмидами. Плазмидные технологии легли в основу введения искусственных генов в бактериальные клетки.
Значительные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных. Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку. Такой процесс получил название трансфекция.
Если модификации подвергаются одноклеточные организмы или культуры клеток многоклеточных, то на этом этапе начинается клонирование, то есть отбор тех организмов и их потомков (клонов), которые подверглись модификации. Когда же поставлена задача получить многоклеточные организмы, то клетки с изменённым генотипом используют для вегетативного размножения растений или вводят в бластоцисты суррогатной матери, когда речь идёт о животных. В результате рождаются детеныши с изменённым или неизменным генотипом, среди которых отбирают и скрещивают между собой только те, которые проявляют ожидаемые изменения.
Векторы доставки генов –ретровирус, которому вместо вирулентного компонента внедрили нормальный ген., а затем в пробирке инкубировали ретровирус и стволовые клетки больных детей. Вирус внедряется в ДНК хозяина, покидает его и часть своей ДНК оставляет в клетке. В клетках появляется фермент, клетки возвращают в кровоток.
СПИД, болезни накопления, гемофилия, наследственная гиперхолестеринемия, онкопатологии, муковисцидоз. потенциально могли бы быть вылечены генной терапией.
Средства доставки нормального гена: ретровирус (тропный к митотически активным клеткам, но встраивается не совсем легко представить куда).
Аденовирусы более точно встраиваются, но их труднее избавить от вирулентных свойств.
Основные проблемы генной инженерии: стабильность внедрения гена, целенаправленность действия, регуляция активности гена, безопасность средства доставки.
Несколько тысяч человек излечены методом генной терапии
Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.