Клеточная селекция

Лекция 13, 14

Цель:изучить методы клеточной селекции, рассмотреть генетические основы применения культуры клеток растений, а также механизмы получения трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям.

План лекции:

1. Методы клеточной селекции

2. Генетические основы применения культуры клеток растений в селекционных целях

2.1 Виды культур растительных клеток, используемые в клеточной селекции

2.2 Преимущества метода клеточной селекции in vitro

3. Получение трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям

3.1 Получение трансгенных растений, устойчивых к насекомым

3.2 Получение трансгенных растений, устойчивых к грибной, бактериальной и вирусной инфекции

3.3 Получение трансгенных растений, устойчивых к гербицидам

1 Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение.

Оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на раз­ных этапах развития и т. д.).

Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питатель­ную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скре­щивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986).

Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде.

Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов.

Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком.

Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений.

Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro . Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления.

Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции.

2 Клетки в культуре in vitro отличаются по морфологии, по биохимическим свойствам, по физиологическому состоянию и генетически. Разнообразие (вариабельность) среди клеточных линий или растений-регенерантов называют сомаклональной вариабельностью. Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариан­тов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro , а также от генотипа и исходного экспланта.

Полиморфизм культивируемых клеток можно объяснить видовыми и возрастными особенностями, уровнем плоидности, влиянием состава пи­тательной среды и условий культивирования, отсутствием коррелятивных связей. Последний фактор, ведущий к нарушению жесткой регуляции, су­ществовавшей в целом растении, видимо, является основной причиной спонтанной изменчивости клеток in vitro .

Любой фрагмент растения представляет собой мозаику различных тка­ней, и в зависимости от того, какая ткань даст начало каллусу, возникшие даже из одинаковых эксплантов каллусы будут гетерогенными и отличающимися друг от друга. Одинаковых, в полном смысле, эксплантов в при­роде быть не может, следовательно, неоднородность исходного материа­ла (видовая, возрастная, физиологическая) предопределяет разнокачественность клеток в культуре.

Физиологическая гетерогенность состоит в том. что клетки в популя­ии находятся в разном физиологическом состоянии, т. е. делятся, растут, стареют, погибают. Такая культура называется асинхронной. Заставить популяцию клеток высших растений проходить фазы клеточного цикла одновременно, т. е. синхронизировать их. почти невозможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению, составляет 2—4%. Неблагоприятные условия (низкая температура, исключение важных компонентов питания), задерживающие деление, в какой-то степени способствуют накоплению числа клеток, готовых к делению. Более эффективны некоторые химические вещества, блокирующие определенные стадии подготовки к делению. В лучших случаях синхронизация может быть достигнута у 10—30% клеток, но при последующих делениях популяция опять быстро утрачивает синхронность.

Следует подчеркнуть, что физиологическая вариабельность клеток в суспензионной культуре меньше по сравнению с культурой каллусной ткани на агаре, что связано с более однородными условиями питания, аэрации и удаления токсических метаболитов из клеточного окружения в жидкой перемешиваемой среде. Гетерогенность культивируемых клеток обусловлена генетической, эпигенетической и модификационной изменчивостью.

Генетические, или мутационные, изменения приводят к изменению генотипа, которое может быть унаследовано. Мутации (изменения количества или структуры ДНК) происходят на генном, хромосомном и геномном уровнях. Генная, или точечная, мутация означает изменение структуры ДНК в одном локусе. Генные мутации приводят к сильным или слабым измене­ниям морфо-

логических, биохимических и физиологических свойств клетки. Мутации, возникающие в результате изменения макроструктуры хромосом, называются хромосомными мутациями, или хромосомными аберрациями (перестройками). Структурные перестройки хромосом возникают в результате инверсии, делеции, дупликации, транслокации и транспозиции. Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в ядре, т. е. с изменениями в кариотипе.

Все виды названных генетических изменений имеют место у клеток in vitro Наиболее подробно исследована хромосомная изменчивость клеток in vitro. Даже клетки одной и той же ткани, выращиваемые в одном сосу­де, могут значительно различаться между собой по хромосомным набо­рам (диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные). Причины генетической изменчивости многообразны: 1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения, т. е. отсутствие организменного контроля; 2) действие компонентов среды; 3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; 4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа.

Хромосомная изменчивость является результатом нарушений митоза, называемых эндомитозом и эндоредупликацией. При эндомитозе проис­ходит спирализация хромосом и начинается митоз, но нарушается вере­тено деления, сохраняется оболочка ядра, хромосомы не расходятся и деспирализуются внутри ядерной оболочки. Это приводит к возрастанию числа хромосом, увеличению размеров ядра и клеток. Эндоредупликация не сопровождается образованием хромосом и делением ядра, хотя со­держание ДНК в ядре тоже увеличивается. К образованию полиплоидных и анеуплоидных клеток также приводят нарушения в митозе, связанные с неправильным распределением хромосом.

Клетки различного уровня плоидности различаются по скорости деления и роста, по устойчивости к неблагоприятным воздействиям, начинают конкурировать, и одни из них начинают преобладать. Такой процесс воз­растающего доминирования в популяции клеток определенного типа называется клеточной селекцией. Доминирование может быть вызвано преимущественной пролиферацией одних клеток или успешной элиминацией (удалением) других. Такую селекцию правильнее называть автоселекцией, потому что она протекает спонтанно, без специального воздействия какими-либо стрессовыми факторами. В процессе автоселекции формируется наиболее приспособленный к данным условиям кариотип. Вероятно, клетки приспосабливаются к новым условиям существования путем отбора более жизнеспособных полиплоидных клеток. Интересно, что изменение условий выращивания меняет направление отбора. Показано, например, что высокие концентрации 2,4-Д и кинетина увеличивают возможность полиплоидизации.

То, что условия выращивания играют важную роль в формировании цитогенетической гетерогенности, хорошо видно из опытов с тканью гаплопаппуса. В лаборатории Р.Г. Бутенко в течение двух лет культивирова­лись меристематические клетки этого растения, пассажи проводились раз в месяц. В итоге исход-ные диплоидные клетки на 95% приобрели другие уровни плоидности. Шведский исследователь Т. Эриксон, работая с этой же тканью, пересаживал ее на свежую питательную среду через каждые 2 дня. При этом штамм сохранил ста-

бильную диплоидную характеристику. Однако способ выращивания не может полностью гарантировать генетическую стабильность в популяции клеток, так как генетической гетерогенностью может обладать сам исходный материал. У многих растений диф­ференцированные ткани имеют клетки разной плоидности. Специализи­рованные клетки, например клетки зеленой ассимилирующей паренхимы листа, запасающих тканей мясистых корней, клубней, зачастую являются полиплоидными.

Спонтанное или индуцированное каким-либо фактором образование различных вариантных форм растений можно использовать для улучшения уже существующих сортов сельскохозяйственных культур.

Как было отмечено, клетки in vitro становятся разнокачественными также благодаря эпигенетическим изменениям, т е. изменениям в программе считки генов или потенции к их активации. Эти изменения генной активности являются наследуемыми.

К ненаследуемым изменениям у клеток в культуре относятся модификационные изменения, которые в большинстве носят адаптивный, приспособительный характер. Эти изменения не затрагивают генетических структур клетки, они соответствуют физиологической адаптации, при которой границы изменений не превышают норму реакции, обусловленной генотипом.

Гетерогенность клеток in vitro возрастает с увеличением продолжи­тельности их культивирования. Различные типы морфогенеза — соматический эмбриогенез или органогенез—также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка — растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше.

Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Например, получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний (В.В. Сидоров и др., 1984, 1985). Для растений табака получе­ны через каллусную культуру сомаклоны, устойчивые к вирусу табачной мозаики. В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не только кормовых и технических культур, но и декоративных и лекарственных растений. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру.

Таким образом, полученные положительные результаты сви­детельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам.

Несмотря на то, что существует генетическая нестабильность культур изолированных тканей и клеток растений, она не может обеспечить потребности селекционеров в генетическом разнообразии. В связи с этим для ускорения селекционного процесса в культуре клеток используются химические и физические мутагены. Обработка ткани раувольфии змеиной азотистым ипритом в концентрации 2,5 * 10-3 М привела к повышению уровня аберраций хромосом в первом пассаже до 32%, вызвала сдвиг популяции в сторону увеличения триплоидов. В результате удалось получить штамм с более высокой биосинтетической активностью по сравнению с исходной тканью.

Спонтанный и индуцированный мутагенез в культуре клеток, тканей и протопластов позволяет получать растения, представляющие практический интерес для селекционеров. Важное практическое значение имеет создание форм растений, устойчивых к неблагоприятному действию факторов внешней среды, таких как низкие температуры, засоление почв, загрязнение природной среды токсическими веществами, поражение вредителями и возбудителями болезней. Эти факторы могут быть использованы в качестве селективного фона в процессе клеточной селекции. Клетки, сохранившие при этом жизнеспособность, могут быть регенерированы в целые растения.

Принципиальной разницы в результатах клеточной селекции при спонтанном и индуцированном мутагенезе нет. Для повышения частоты мутаций в соматических клетках обычно используют такие мутагены, как нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, метилметансульфонат. Реже применяют облучение ультрафиолетом, γ-квантами 60Со и нейтронами.

В качестве селективных агентов используют антибиотики, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, фито- и патотоксины, агенты, вызывающие солевой и водный стресс, аналоги аминокислот и т.д.

Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:

— прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток;

— непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений;

— тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны;

— визуальная селекция и неселективный отбор, когда ва­риантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.). Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам.

2.1 Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или переса­дочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токси­ческих веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на пе­речисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверяет­ся стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов—возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCl или Na₂S0₄. Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз - триптофана, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер. Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества. Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивиро­вания и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29 и Московская-35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993).

Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

2.2 По сравнению с экспериментальным мутагенезом на уровне целых растений метод мутагенеза на уровне клеток имеет ряд преимуществ:

- экономится площадь, так как в одной чашке Петри диаметром 10 см можно культивировать 107 – 108 клеток, а для такого же количества растений необходима площадь свыше тысячи гектаров;

- мутантные признаки на уровне отдельных клеток проявляются довольно быстро;

- возможно получение новых типов мутаций, в том числе и биохимического характера;

- экономится время и трудозатраты на получение нового желаемого признака. Важным условием является также возможность получения гаплоидов у того или иного вида растений. В дальнейшую селекционную работу включаются только те генотипы, у которых мутации проявляются на уровне целого растения. Растения с измененными признаками, полученные в результате мутагенеза на клеточном уровне, называются вариантами (термин «мутант» используется тогда, когда мутация подтверждается генетическими или молекулярно-

генетическими методами). Рекомендуются следующие обозначения: R0 – растения-регенеранты, полученные из соответствующих клеточных клонов, R, R2 и т.д. – первое и последующее поколения после самоопыления. Общая схема получения мутантных форм путем селекции на клеточном уровне состоит из нескольких этапов (рис. 17):

Измененные при мутагенной обработке клетки могут быть выделены в условиях культивирования in vitro путем прямого и непрямого отборов, а также при тестировании отдельных клеточных колоний. Прямой отбор состоит в добавлении к питательным средам отдельных компонентов, к которым обычные, неизмененные клетки не устойчивы. Непрямой отбор (негативная селекция) заключается в создании условий культивирования, при которых рост неизмененных клеток либо задерживается, либо эти клетки погибают (например, культивирование при низких или высоких температурах на средах с недостатком отдельных компонентов и т.д.). Существует ряд факторов, ограничивающих селекцию in vitro Многие хозяйственно важные признаки, такие, как урожайность, количество зерна, устойчивость к пестицидам и другие трудно или практически невозможно получить при культивировании in vitro поскольку они не проявляются на клеточном уровне.

Рис. 17. Схема получения мутантных форм путем клеточной селекции

Недостаточно также биохимических и молекулярных маркеров, которые коррелировали бы с этими признаками на уровне целых растений. Не все селектируемые признаки, проявляющиеся на уровне клеток, сохраняются на уровне растений - регенерантов. Тому несколько причин: некоторая часть изменений не затрагивает генетический аппарат клетки, поэтому не сохраняется у потомков; генетические изменения могут элиминироваться в про цессе дифференциации и мейоза; функция мутированного гена может быть ограничена состоянием дифференцируемых и культивируемых клеток; мутация одного гена может сопровождаться активацией различных генов, кодирующих изоферменты; часть генотипов неспособна регенерировать нормальные фертильные растения.

3Экстремальное влияние окружающей среды, такое как засуха, избы­точное увлажнение, воздействие высоких или низких температур, засоле­ние и кислотность почв приводит к значительным потерям сельскохозяй­ственной продукции. Поэтому использование сортов растений, толерант­ных к стрессовым воздействиям, имеет большое экономическое значе­ние.

Многие из адаптивных реакций растений на стресс обусловливаются синхронным взаимодействием множества генов. Поэтому более доступ­ными для генно-инженерных исследований оказываются биохимические процессы, непосредственно индуцировавшиеся фактором стресса. Так, например, известно, что в растениях, подвергающихся длительному вод­ному стрессу, накапливается ряд органических низкомолекулярных со­единений, таких, как пролин, глицинбетаин и ряд других, которые служат ос мо регуляторами или осмопротекторами. Было показано сходство стрессового ответа у бактерий и высших рас­тений: в обоих случаях в клетках происходит синтез молекул осмопротекторов, механизмом действия которых является установление осмоти­ческого баланса между цитоплазмой и окружающей средой и, кроме того, частичная стабилизация белков при стрессовых условиях. Сходные био­химические пути синтеза молекул осмопротекторов позволили использо­вать гены бактериального происхождения для получения трансгенных растений, устойчивых к стрессам.

Из генома Е. сoli были выделены два гена proBosm и proA, кодирую­щие ферменты пути биосинтеза пролина, аккумулирование которого в клетке происходит в ответ на осмотический стресс. Экспрессия этих бак­териальных генов в геноме растений приводила к повышенному синтезу пролина. Полученные трансгенные растения табака осуществляли повы­шенный синтез и накопление пролина по сравнению с контрольными рас­тениями. Трансгенные побеги укоренялись и могли расти при концентра­ции соли в среде 20 г/л (350 мМ).

Был выделен ген бетаинальдегиддегидрогеназы (ВАDН), которая ка­тализирует синтез глицинбетаина. Трансгенные растения табака, экспрессирующие этот ген, обладали повышенной солеустойчивостью.

Было показано, что устойчивость к высоким температурам связана с геном Fad7, белок которого влияет на метаболизм жирных кислот. Инак­тивация такого гена в трансгенных растениях риса привела к тому, что растения могли расти при повышенных температурах и выдерживать до двух часов при +47°С.Сейчас проходят полевые испытания сорта трансгенных газонных трав на засухоустойчивость и устойчивость к засолению с тем, чтобы в дальнейшем их можно было использовать в больших городах с характерным абиотическим фоном.

3.1 Используя генно-инженерные методы, возможно конструирование растений с повышенной резистентностью к атаке насекомыми. Так, было показано, что бактерии Bacillus thuringiensis экспрессируют инсектицидный белок-прототоксин, который, попадая в кишечник насекомых, рас­щепляется под действием протеаз до активного токсина, приводящего к гибели вредителей.

Препараты на основе этого токсина использовались для обработки растений в поле. Полученные препараты были нестойкими и довольно быстро разлагались, что не позволяло развить у вредителей устойчивость к инсектициду, в то время как продукция таких белков в растительных клетках могла обеспечивать устойчивую резистентность растений к насе­комым.

Из генома В. Thuringiensis был выделен ген токсина bt 2 и поставлен под контроль промотора 35S СаМV. bt-Ген был интегрирован в геном растений табака методом агробактериальной трансформации. Экспрес­сия бактериального bt2-гена в растительных клетках была подтверждена как на уровне транскрипции, по присутствию соответствующей мРНК, так и на уровне трансляции, по синтезу белка-токсина. Полученные трансгенные растения табака были устойчивы к вредителям. Эффектив­ность защиты сельскохозяйственных культур от вредителей была показа­на и на трансгенных растениях томата, трансформированных генами эн­дотоксина, при этом бактериальный белок, синтезированный в тканях растений, обеспечивал защитный эффект, сравнимый с использованием инсектицидных препаратов.

Помимо табака и томата бактериальный bt 2-ген был введен в геном многих сельскохозяйственных растений, в том числе в картофель, кукурузу, хлопчатник, рис, сою, брокколи и др. Для ряда культур получены сорта трансгенных растений, экспрессирующих в своем геноме bt2-ген. Так, в 1994—1995 гг. были получены и прошли полевые испытания сорта томата, картофеля и хлопчатника (фирма «Моnsanto»), кукурузы как тор­говой, так и пищевой сахарной (фирма «Novartis»), а в 1998 г. был полу­чен сорт картофеля с тройной устойчивостью, который помимо bt2-гена, содержал ген устойчивости к вирусу скручивания листьев и ген устойчи­вости к гербициду глифосату. В 2000 г. в странах с разрешенным использованием генетически модифицированных продуктов сортами трансген­ных растений, устойчивых к насекомым, были засеяны около 380 тыс. га, из них: 230 тыс. га — трансгенным хлопчатником, 144 тыс. га трансген­ной кукурузой, 5 тыс. га — трансгенным картофелем. Использование трансгенных растений привело к резкому сокраще­нию применения инсектицидов и повышению урожайности.

3.2 При действии фитопатогенов в растениях включается каскад меха­низмов защитных реакций. При этом активные ответные реакции в расте­ниях могут проходить по двум основным направлениям: во-первых, в от­вет на инфекцию начинается синтез соединений, являющихся токсичны­ми и ограничивающих жизнедеятельность патогенов, что в конечном итоге приводит к их гибели. Во-вторых, в качестве защитного ответа мо­гут создаваться структурные барьеры, которые предотвращают повреж­дение растений и распространение патогенов, что достигается лигнификацией клеточных стенок растений, либо укреплением клеточных стенок за счет гликопротеидов, богатых гидроксипролином и других соедине­ний, так называемых экстенсинов, что приводит к защите тканей от по­вреждения фитопатогенами.

В ответ на инфицирование вирусами, бактериями и грибами индуци­руются специфические РR-белки (pathogenesis related proteins), в том чис­ле и наиболее изученные хитиназы и β-1,3-глюканазы. Эти ферменты ингибируют рост грибов, а также некоторых видов бактерий.

Экспериментально был доказан фунгицидный эффект белков хитиназ и глюканаз, а также их кодирование одиночными генами. Поэтому гены хитиназы и глюканазы были использованы в генно-инженерных работах по получению трансгенных растений, устойчивых к фитопатогенам. Были получены трансгенные растения табака, хлопка, кукурузы, рапса, томата, риса, картофеля, люцерны, турнепса и других, экспрессирующих ген хитиназы под контролем промотора 358 СаМV. У этих растений на­блюдалась устойчивость к грибной инфекции. В настоящее время полу­чены трансгенные сорта табака, рапса, томатов, картофеля с повышенной устойчивостью к Rhizoctoniа, растения табака — к Cercospora nicotiana.

Другую группу соединений, также обладающих фунгицидным эф­фектом, представляют низкомолекулярные белки (40—50 кДа), к кото­рым относятся цистеиновые белки растений, ингибиторы галактуроназ, растительные дефензины, группа МF-белков. Все эти белки обычно не­специфически повышают устойчивость растений к различным грибным и бактериальным инфекциям. Трансгенные растения, экспрессирующие этот белок, обладают устойчивостью как к грибной, так и к вирусной ин­фекции.

В процессе изучения взаимоотношений вирус — растение было во­влечено большое число различных методов. Только их комбинирование могло принести результаты по получению растений, устойчивых к вирус­ной инфекции. За последние годы в этом направлении был сделан замет­ный рывок, что напрямую связано с более детальным пониманием орга­низации генома и функционирования вирусных генов. В настоящее время для получения растений, устойчивых к вирусной инфекции, с помощью генно-инженерных технологий существует ряд подходов, позволяющих получить трансгенные растения, трансформированные геном белка обо­лочки вируса, что приводит к уменьшению инфицированности и ингибированию размножения вируса. Таким методом были получены растения табака и картофеля, трансформированные геном белка оболочки вируса табачной мозаики, что привело к появлению стойкого антивирусного эф­фекта у трансгенных растений.

В настоящее время получены линии табака, которые, помимо устой­чивости к ВТМ, резистентны к вирусу тыквенной мозаики. Были также получены растения картофеля и кукурузы, устойчивые к вирусам скручи­вания листьев, и растения ячменя, резистентные к вирусу карликовости. В настоящее время получен и выращивается сорт тыквы, обладающий ус­тойчивостью сразу к трем вирусам.

Еще одним подходом к получению устойчивых к патогенам растений является трансформация растительных клеток генами, кодирующими ферменты пути биосинтеза фитоалексинов, проявляющих фунгицидное и антимикробное действие. Трансформация этими генами растений томата и картофеля значительно повысила устойчивость к фитофторозу и фузариозу, а табака—к серой

гнили. В настоящее время получены четыре трансгенных коммерческих сор­та картофеля, устойчивые к Y вирусу (РVY) и вирусам скручивания ли­стьев (РLRV), сорт тыквы, устойчивый одновременно к трем различным вирусам, сорт папайи, устойчивый к круговому вирусу папайи (РRV).

3.3 Одним из основных направлений биотехнологии растений является получение культурных растений, устойчивых к воздействию гербицидов. Гербициды широкого спектра действия, уничтожая сорные травы, оказы­вают угнетающее действие и на посевы. Получение устойчивых к герби­цидам растений ведется в двух направлениях: во-первых, прямая селек­ция устойчивых к гербицидам форм растений (в основном, путем скре­щивания с дикими видами растений, устойчивых к гербицидам), во-вторых, получение трансгенных растений путем введения генов, экпрессия которых приводит к гербицид-резистентности. Теоретической основой получения трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, являются данные о молекулярных механизмах возникновения устойчивости к гер­бицидам и выделения генов как бактериального, так и растительного про­исхождения, определяющих этот признак. Действие гербицидов проявля­ется в подавлении метаболизма растительных клеток: ингибировании биохимических процессов прежде всего фотосинтеза (атразин, симазин, диурон) и синтеза аминокислот (глифосат, сульфон ил мочевина, биала-фос). Устойчивость к гербициду возникает либо в результате изменения сродства гербицида с его ферментом-мишенью, либо непосредственно ингибированием молекулы гербицида. Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной ин­женерии прежде всего основывается на изучении молекулярных меха­низмов толерантности и включает следующие этапы: выявление мише­ней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, ус­тойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. Действие гербицида атразина основано на его связывании с хлоропластным мембранным белком Qb, который кодируется геном рЬс А. Ген рbс А был выделен из генома некоторых сорняков. Было показано, что ус­тойчивость к гербициду связана с возникновением точечной мутации в гене рbсА, что приводит к замене в белке аминокислотного остатка серина на глицин. Такие замены в белке Qb приводят к резкому уменьшению связывания гербицида с ферментом-мишенью. В результате возникает устойчивость к гербициду. Мутантный ген рЬс А был встроен в векторные конструкции для трансформации растений. Полученные трансгенные рас­тения были устойчивы к атразину. Аналогично показано, что замена аланина на аргинин в белке EPSP-синтетазы, который кодируется геном аrо А Е.соli, приводит к воз­никновению устойчивости к действию гербицида глифосата. Это было использовано для трансформации клеток табака, томатов, сахарной свек­лы и картофеля мутантным геном аrо А и получения трансгенных расте­ний, устойчивых к гербициду. Введение в геном растений бактериального гена bar приводит к появ­лению устойчивости к гербициду ВАSТА. Было показано, что белок, ко­дируемый bar-геном,- фосфинотрицинацетилтрансфераза - ацетилирует активный компо-

нент гербицида фосфинотрицин, что приводит к его инактивации. Получены сорта трансгенного риса (1995), сорго (1995), пшеницы (1994) и ряда других растений. В последнее время bar-ген стал использоваться и в качестве селективного маркера в генно-инженерных векторах. Введение в геном риса гена, кодирующего фермент протопорфирино-генсинтетазу (Protox, выделенного из бактерий В. subtillis, привело к по­вышению устойчивости трансгенных растений к гербицидам дифенилэфирового ряда. При этом был показан механизм антигербицидного дей­ствия: повышенная экспрессия этого белка Ргоtох нейтрализует действие гербицида, чем и обусловлено повышение устойчивости к нему. При этом была показана прямая зависимость между числом встроенных копий гена и уровнем устойчивости.

В настоящее время в странах Северной Америки и Европе разрешены к применению более 20 сортов трансгенных растений, устойчивых к гер­бицидам, таких важных сельскохозяйственных культур, как кукуруза, хлопок, рис, соя, пшеница, картофель, томаты, лен. Проходят полевые ис­пытания трансгенные сорта клубники, сахарной свеклы и некоторых цве­точных культур. Всего в мире трансгенными сортами и гибридами, ус­тойчивыми к гербицидам, засеяно около 34 млн. гектаров, или 80% от всех посевов трансгенных сортов. В целом можно говорить о том, что получение трансгенных растений является одним из наиболее бурно развивающихся направлений биотех­нологии. К февралю 2001 г. в странах, с разрешенным использованием ге­нетически модифицированных растений были проведены испытания и разрешены к коммерческому использованию 78 сортов трансгенных рас­тений 18 возделываемых культур.

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение клеточной селекции?

2. Какие культуры применяются в качестве селекционных агентов?

3. Способы получения трансгенных растений?

4. Преимущества клеточной селекции?

5. Методы проведения селекции?

6. Для чего применяются трансгенные растения?

7. К каким стрессовым факторам устойчивы трансгенные растения?