Синдром Коккейна. (CS)

Мы уже несколько раз упоминали это заболевание раньше. Было показано, что по многим признакам CS можно рассматривать как один из большой группы так называемых транскрипционных синдромов, особенно когда речь шла о больных, генетически связанных с ХР. В тоже время синдром Коккейна во многих случаях не имеет никакой связи с ХР, и будет нами здесь представлен как независимое заболевание. Этот редкий синдром был описан в середине тридцатых годов Коккейном. Считается аутосомным рецессивным генетическим заболеванием, описан в семьях, часто проявляется в результате родственных браков.

Больные страдают карликовостью в результате задержки роста и развития с самого раннего возраста. Среди наиболее часто встречающихся признаков – фоточувствительность, глухота, атрофия зрительного нерва, удлиненные по отношению к туловищу конечности, большие уши и нос, глубоко запавшие глаза и ускоренное старение. Пациенты умирают в возрасте около 12 лет. В тех редких случаях, когда они доживают до 18–20 лет, у них в отличие от ХР нет выраженной предрасположенности к опухолям (как и у TTD). Необычная чувствительность этих больных к солнечному свету позволила сделать предположение о наличии дефекта в репарации УФ-повреждений ДНК. Фибробласты больных CS показывают резко пониженную выживаемость после УФ-облучения по сравнению с клетками здоровых доноров. Эта чувствительноть к ультрафиолету коррелирует с повышенной чувствительностью к химическим агентам, считающимся УФ-миметиками. Например, к N-ацетокси-N-2-ацетил-2-аминофлюорену или 4-нитрохинолину. Некоторыми авторами описана также и чувствительность к гамма-облучению. При этом обычно клетки больных синдромом Коккейна не чувствительны к гамма-миметикам (алкилирующим агентам в том числе).

При облучении клеток нормальных доноров ультрафиолетом мы наблюдаем немедленное подавление валового синтеза ДНК в степени, зависимой от дозы, а затем полное восстановление исходного уровня в течение 5–8 часов. В клетках больных синдромом Коккейна, как и больных пигментной ксеродермой, наблюдается явный дефект этого восстановления. В растущих клетках CS также наблюдается подавление синтеза РНК УФ-облучением, но восстановление идет несколько быстрее, чем в случае ДНК синтеза. Этот феномен дефектного восстановления синтеза РНК после УФ-облучения обычно используется как диагностический критерий для дискриминации синдрома Коккейна. Этот дефект коррелирует с наличием карликовости, умственной осталости и чувствительности к солнечному свету.

Больные синдромом Коккейна, как и пигментной ксеродермой, относятся к нескольким различным группам комплементации, основными среди которых являются две – А и В. При этом надо отметить, что те редкие случаи, когда мы наблюдаем признаки синдрома Коккейна у больных пигментной ксеродермой групп B, D и G, не относятся к этим двум группам комплементации, а рассматриваются отдельно и обозначаются как XPB/CS; XPD/CS и XPG/CS. Таким образом, к настоящему времени у синдрома Коккейна описано 5 различных групп комплементации.

Ген CSA клонирован и кодирует белок, относящийся к древней группе белков, часто называющихся семейством с WD-повторами, WD-40-повторами или GH-WD-повторами. Белки этого семейства не обладают какими-либо каталитическими свойствами, но способны служить передатчиками сигналов внутри клетки. Мне бы хотелось остановиться на них немного подробнее. Эти белки получили свое название из-за того, что внутри каждого белка имеется от 4 до 8 высококонсервативных аминокислотных последовательностей, содержащих от 23 до 41 аминокислот и фланкированных с одной стороны GH (Gly-His), а с другой – WD (Trp-Asp). Таких белков обнаружено 27 (CSA – 28-ой), причем функция 20 из них уже ясна, хотя бы приблизительно. Впервые WD-повтор был обнаружен в β-субъединице GTP-белка, или, как их теперь обычно называют, G-белка, который передает сигнал через плазматическую мембрану; и был назван β-трансдуцин-повтором. Этот белок усиливает связывание α-субъединицы G-белка с рецепторами гормонов и другими внутриклеточными сигнальными молекулами, способствуя объединению в тройной комплекс рецептора и G-α-β-γ. Эта способность G-β облегчать объединение различных белков и образование мультибелковых комплексов может служить ключом к пониманию функций и других белков, содержащих WD-повторы. Например, особая роль в объединении макромолекул во время сплайсинга мРНК (белок Prp4), модификации мРНК (белок CstF), транскрипции (TafII80; TUPI). Аналоги G-β субъединицы были описаны и у других организмов, включая дрожжи и диактиостилиум, и показали очень высокую степень консерватизма между последовательностями повторов, находящихся в одинаковом положении внутри белка (у G-β-белка этих повторов 5 и они обозначаются повтор 1 G, повтор 2 G и т. п.). Таким образом, мы видим, что эти белки сохраняют свои последовательности не менее 1 миллиона 200 тысяч лет, которые отделяют эволюционно человека от диктиостилиума и дрожжей. Подобная же картина наблюдается и в других группах WD-белков.

Таким образом, все описаные до сих пор группы белков с WD-повторами показывают крайне высокую степень эволюционного консерватизма, сравнимую только с таковой у гистонов (взаимодействующих с широким кругом различных белковых и ДНК-овых последовательностей) и кальмодулинов (взаимодействующих с большим числом несвязанных энзимов, регулирующих обмен ионов Са++). Из этого можно сделать вывод, что и у белков, содержащих WD-повторы, их функции были определены по меньшей мере более 1.200 миллиона лет назад. Способность же этих белков к многомерному связыванию с другими белками указывает на их значение в физиологическом объединении различных клеточных процессов.

Белок CSA содержит 396 аминокислот и имеет молекулярную массу приблизительно 44 кД. Ген, кодирующий этот белок, был картирован на 5 хромосоме – 5р14-р12. Этот белок образует комплекс с белком CSB и белком р44, входящим в состав того же самого транскрипционного комплекса TFIIH, что и белки XPB и XPD. Отвечает за это связывание N-конец белка, так как даже обрезанный CSA белок, содержащий только N-конец с 146 или 187 аминокислотными остатками был способен взаимодействовать и с CSB и с р44.

Ген, кодирующий белок CSB, был определен несколько раньше также с помощью функциональной комплементации чувствительности к ультрафиолету клеток одного из штаммов грызунов, дефектного по гену ERCC6. Он оказался способным исправлять клеточный фенотип клеток от больных CSB. Таким образом была доказана идентичность двух генов – CSB и ERCC6. У человека этот ген картирован на 10q11.2 и кодирует полипептид, содержащий 1493 аминокислоты с молекулярной массой около 169 кДа. Этот белок имеет несколько специфических областей. Например, последовательность между 356–394 аминокислотными остатками содержит 60 % глутамина и аспаргина, включая 10 кислых остатков подряд. Подобные кислые районы были обнаружены во многих ядерных белках, связывающихся с хроматином или с гистонами. Наиболее интересной чертой этого полипептида является участок, содержащий около 400 аминокислот (527–950), в его середине. Этот участок охватывает согласованную группу нуклеотидов, высококонсервативную и характерную для обширного семейства белков, обозначаемых как SWI/SNF семейство. На сегодняшний день известно 29 членов этого семейства. Внутри каждого белка этого семейства тот самый участок приблизительно в 400 аминокислот состоит из очень консервативных коротких последовательностей аминокислот, прерываемых более протяженными менее консервативными последовательностями, которые варьируют по размерам у разных членов семейства. Вначале таким образом были описаны два суперсемейства ДНК и РНК геликаз. При более подробном исследовании этой гомологии, было выдвинуто предположение о существовании по крайней мере 8 подсемейств, одно из которых включает человеческий полипептид CSB и его дрожжевой гомолог Rad26. Другое подсемейство включает дрожжевой полипептид Swi2/Snf2, который является ДНК-зависимой АТФ-азой, входящий в состоящий из по крайней мере 11 субъединиц мультибелковый комплекс, вовлеченный в активацию транскрипци у дрожжей (SWI/SNF комплекс), и его гомологи у человека и дрозофилы. Третье подсемейство включает белок дрозофилы ISWI, который тоже является частью мультибелкового комплекса, называемого NUFR, принимающего участие в транскрипции. АТФ-азная активность комплекса предположительно связана с ISWI белком. Предполагают, что оба эти комплекса могут быть "молекулярными машинами", вызывающими активацию транскрипции с помощью механизмов, вовлеченных в ремоделирование хроматина. Вероятно, в суперсемействе SWI/SNF содержатся АТФ-азные субъединицы различных хроматин-ремодулирующих комплексов (каждому соответствует свое подсемейство SWI/SNF белков), основной функцией которых является нарушение структуры хроматина для различных операций с ДНК, не обязательно именно для транскрипции. Участие подобного хроматин-ремодулирующего комплекса в репарации ДНК выглядит вполне естественным. В белке CSB присутствует также и геликазный мотив, но данные о его геликазной активности пока экспериментально не подтверждены. CSB белок также имеет общие последовательности с фактором, связывающим транскрипцию и репарацию E.coli (TRCF). К настоящему времени сложилось представление, что CSB белок является функциональным гомологом TRCF и что он (по-видимому, вместе с белком CSA) играет особую роль в привлечении белков эксцизионной репарации в район остановившейся транскрипции и/или их взаимодействии с РНК-полимеразным комплексом. Об этом мы подробнее будем говорить при обсуждении пострепликативной репарации.

Существует много наблюдений, подтверждающих представление о сопряженном дефекте репарации и транскрипции при синдроме Коккейна. Во всех случаях, когда это заболевание диагностировалось, на клеточном и молекулярном уровне наблюдались мутации в генах, кодирующих белки либо прямо входящие в состав транскрипционного комплекса TFIIH, либо взаимодействующие с ним. К тому же все тяжелые симптомы этого заболевания невозможно объяснить только с точки зрения репарации ДНК, тогда как их реальной причиной могут быть сниженный уровень и нарушение последовательности транскрипции в онтогенезе.