Гибридизационная селекция

Метод прямой радиоиммуннологической детекции колоний.

Тест на комплементацию

Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные молекулы

Отбор клонов, несущих нужную рекомбинационную молекулу

В большинстве экспериментов по молекулярному клонированию используется сложная смесь фрагментов ДНК. Существуют специальные приемы, позволяющие отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Например, при применении фазмид дают урожай исключительно фаговые корпускулы, в головки которых пакуются рекомбинантные молекулы. При применении плазмид отбирают клоны с рекомбинантной ДНК по инактивации одного из маркеров плазмид и т.д. Гораздо сложнее найти среди рекомбинантов клон, несущий ген.

Основан на изменении фенотипа клетки под влиянием синтезируемого белка, либо просто на свойствах самого белка.

Например, если необходимо изолировать гены E. Coli, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислоты мутанты и получая прототрофные клоны.

Используются обычно при «самоклонировании», то есть при переносе генов на многолинейных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов.

Колонии клеток, несущие рекомбинантные молекулы, лизируют на поверхности агара, а затем отпечатывают на поливиниловую пластику, на которой адсорбированы антитела. После отмывки диски обрабатывают меченными I125 антителами к белку искомого гена. Таким образом, образуется комплекс антигена с двумя молекулами антитела, одна из которых мечена иодом, а вторая присоединяется к пластинке. Образование комплекса тестируется радиоавтографически.

Клоны могут быть идентифицированы по первичной структуре ДНК или по характеру белка, синтезирующего в подходящей системе (ооциты лягушки, бесклеточные экстракты). Тестирование первичной структуры ДНК осуществляется меченой очищенной мРНК. Трудности метода связаны со сложностью получения гомогенных препаратов мРНК. Кроме того, клоны, дающие позитивный ответ при гибридизации, не обязательно содержат нужный ген или его часть.

Денатурируют клонированную ДНК, иммобилизируют ее на твердой матрице и гибридизируют ее с препаратом мРНК. Дуплекс ДНК-РНК нагревают с препаратом мРНК, которую затем добавляют в бесклеточные белоксинтезирующие системы для трансляции. Продукты трансляции идентифицируют или по биологической активности, или по иммуноприцептацией. Последний метод чрезвычайно трудоемок, но позволяет обнаружить в библиотеке клоны, содержащие кДНК, мРНК которая представлена в количестве 0,03-0,01% от суммарной клеточной мРНК.

Если известна первичная структура гена или кодируемого им белка, или хотя бы их фрагментов, то для скрининга клонов можно использовать синтетические олигонуклеотиды – зонды. Зонды не должны быть короче 14-15 п.о. Лучше брать 2 зонда одновременно к различным участкам одного и того же гена. В силу вырожденности кода, если известна только аминокислотная последовательность, приходящаяся синтезировать набор олигонуклеотидов, из которой будет полностью комплементарен к искомому гену.