Методы генетического конструирования in vitro

Включают работу с рекомбинантной ДНК. Суть этой технологии заключается в воссоединении фрагментов ДНК in vitro, т.е. в «пробирке» с последующим введением новых («рекомбинантных») генетических структур в живую клетку.

Т.к. с химической точки зрения ДНК всех организмов однотипна, то in vitro возможно воссоединение фрагментов ДНК из любых организмов. В этом смысле, рекомбинация in vitro отличается от обычной генетической рекомбинации, которая требует гомологи ДНК и, как правило, осуществляется в пределах одного или близкородственных видов.

Техника генетической инженерии впервые позволила получать индивидуальные фрагменты ДНК в достаточных количествах из гомологов любой степени сложности. В сочетании с методами быстрого определения последовательности оснований в ДНК эта техника впервые открыла исследователям путь к выяснению строения генов высших организмов, в том числе и человека.

Основные принципы: сначала нужно выяснить главным философским итогом развития современной биологии являлось выявление удивительной универсальности жизни на молекулярном уровне. Во всех живых системах носители генной информации нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК), причем на языке универсального генетического кода. Молекула АТФ – общий переносчик энергии, 20 аминокислот состоят белки всех живых организмов. Особенно важно, что воспроизведение макромолекул в живых системах также подчиняется общим принципам.

Типовой эксперимент в генной инженерии состоит из следующих этапов:

1. получение фрагмента (или смеси фрагментов) ДНК

2. конструирование in vitro рекомбинантных молекул ДНК, состоящих из фрагментов, полученных на первом этапе, и небольших автономных реплицирующиеся в клетке – реципиента структур (плазмид, фагов, вирусов), носящих название вектор

3. введение рекомбинантных ДНК в клетку – реципиент

4. отбор клонов, несущих нужную рекомбинационную молекулу

Схема типичного опыта

Плазмида – вектор и чужеродная ДНК расщепляется эндонуклеазой рестрикции, образуя фрагменты линейной двунитевой ДНК с комплиментарными «липкими концами». В процессе «отжига» (процесс реассоциации молекул ДНК с образованием водородных связей между комплиментарными основаниями) могут образоваться различные комбинации фрагментов, в том числе и кольцевая структура, содержащая вектор и искомый фрагмент чужеродного ДНК. Обработка лигазой делает кольцо ковалентно замкнутыми. После трансформации и высева на селективную среду отбирают колонии, несущие гибридную плазмиду.