Метод in situ гибридизации

Авидин-биотиновые методы

Авидин-биотиновые методы резко повышают чувствительность иммуногистохимической реакции за счет высокой аффинности авидина или стрептавидина к биотину. Авидин – белок, содержащийся в сырых куриных яйцах, при варке теряет активность по отношению к биотину. Биотин – водорастворимый витамин Н (B7), и при биотинилировании ковалентно присоединяется к антителам

Интенсивность окрашивания является функцией активности фермента, поэтому увеличение числа молекул фермента, маркирующего антиген, приводит к повышению чувствительности реакции. Идеальную систему для такого усиления представляет формирование многочисленных связей между биотинилированными антителами, связанными с антигеном и 4-валентным по отношению к биотину авидином.

АВС-комплекс. В коммерческий набор для проведения этой реакции входит крупный макромолекулярный комплекс, представляющий собой биотинилированный фермент (пероксидаза или кислая фосфатаза), преинкубированный с авидином. Обычно это – два флакончика, которые смешиваются перед использованием.

На срез, инкубированный с первичными антителами, наносят вторичные биотинилированные антитела. Затем добавляют комплекс биотинилированный фермент-авидин. Все биотин-связывающие сайты авидина связываются с биотином на вторичных антителах, которые, в свою очередь, связаны с первичными специфическими антителами. Таким образом увеличивается число молекул фермента на один антигенный сайт, - повышается чувствительность.

Кроме высокой чувствительности, АВС-метод позволяет использовать меньшее количество первичных антител, а также сокращает время проведения исследования.

Недостатками АВС-метода является необходимость блокирования эндогенного биотина в некоторых тканях и затрудненное проникновение в ткань крупных молекулярных комплексов в некоторых случаях.

Авидин-биотиновые методы более чувствительны, чем другие прямые и непрямые иммуногистохимические методы. Они стандартизованы для использования в широкой диагностической практике и находят все большее применение в медико-биологических исследованиях.

Принцип in situ гибридизации крайне прост: денатурированная меченая нуклеиновая кислота наносится на цитологический препарат, прошедший необходимую предобработку, создаются условия для формирования дуплекса меченой ДНК и ДНК цитологического препарата, несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция гибридизованного ДНК-зонда. Впервые in situ гибридизация с ³²Р-меченным зондом была описана в 1969 г. Важным шагом в развитии in situ гибридизации явилась разработка нерадиоактивных систем мечения и детекции ДНК зондов. Метод in situ гибридизации стал более безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов.

В настоящее время метод in situ гибридизации широко используют для выявления вирусных нуклеиновых кислот в клетках в научных и диагностических исследованиях.

Изначально метод in situ гибридизации был разработан для целей цитогенетики, для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Проведение такой локализации одновременно с цитологическим анализом морфологии клеточных структур привело к настоящей революции в цитогенетике, что в свою очередь определило наступление в 90-е годы новой эры хромосомного анализа при онкологических заболеваниях.

Произошел переход с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной.

Совершенствование методов мечения ДНК-зондов, проведения гибридизации и детекции меченой ДНК на цитологических препаратах позволило перейти от анализа распределения в хромосомах кластерированных повторов к локализации уникальных последовательностей.

В современной цитогенетике используется многоцветная FISH. В ее основе лежит комбинаторное мечение, при котором ДНК-зонд метится не одним, а комбинацией флуорохромов, и регистрация ведется для всех точек изображения интенсивности свечения всех флуорохромов. В этом случае одновременное использование n числа флуорохромов позволяет получить значительно большее число псевдоцветов. При использовании для мечения зондов всего пяти флуорохромов такой подход позволяет одновременно анализировать результаты гибридизации 31 ДНК-зонда. Этого с запасом хватает для индивидуальной визуализации в одной метафазе материала всех хромосом человека.

Электронная микроскопия.

Электронный микроскоп был изобретен в 1933 году и является сложным прибором, в котором сочетаются достижения вакуумной техники и электроники. В электронном микроскопе вместо света используется поток электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями. Источником электронов, т. е. катодом, служит вольфрамовая нить, испускающая электроны при нагревании. В центре анода имеется небольшое отверстие. Сквозь него проходят электроны, и пучок их фокусируется магнитной катушкой, играющей роль линзы, которая направляет его на объект. Когда пучок электронов уже прошел через объект, изображение его увеличивается с помощью второй магнитной катушки, которая действует как линза объектива; затем пучок электронов проходит через третью магнитную катушку, действующую в качестве окуляра или проекционной линзы и увеличивающую уже полученное изображение объекта.

Стабильность напряжения. Ускоряющее напряжение. Виброустойчивость электронного микроскопа. Тепловая стабильность. Система охлаждения. Вакуум в колонне микроскопа (около 10^-5 Па) обеспечивает прохождение электронного пучка и чистоту исследуемого образца. Гониометр.

Диапазон увеличений (от 800-1000 до 850 000 раз). Калибровка.