Перенос участков бактериальной ДНК
Действие мутации на трансляцию
1. Бессмысленные мутации (миссенс-мутации). В клетке имеется транспортная РНК для 64 возможных нуклеотидных кодонов, кодирующих структуру иРНК. Есть 3 исключения - бессмысленные кодоны. Любой из них действует как выключатель, замыкающий конец цепочки в ходе синтеза белка. Такие мутации названы бессмысленными.
2. Фреймшифт-мутации. Они затрагивают ген, это сдвиг считывания, т.е. изменение всех последующих кодонов.
3. Супрессорные мутации. Это мутации клеток, восстанавливающие функции клеток, инактивированных предыдущей мутацией. Это риверсия мутации клеток, вызванной, к примеру, профлавином - с помощью второй мутации внутри того же гена. Таким образом, такая риверсия является примером внутригенной супрессорной мутации. Они могут быть и внегенными. Особи, возникшие в результате обратных мутаций, называются ривертанты. .
4. Мутации на клеточном уровне. Генетическую мутацию можно выявить, если она вызывает фенотипические изменения клеток.
5. Мутации с приобретением. Это мутации, в результате которых, гены приобретают новые возможности. Когда мутация добавляет клетке способность синтезировать активный фермент, лаг-фаза между мутацией и временем синтеза фермента отсутствует.
6. Мутация с утратой. Когда мутация вызывает прекращение синтеза какого либо фермента, клетка сохраняет ферментативную активность. Если рост клетки продолжается, то количество фермента уменьшается в 2 раза с каждым делением.
Рекомбинации (лат. combinatio - соединение) - это перегруппировка, возникновение новых последовательностей в хромосоме, в результате сочетаний двух хромосом. Это дает неисчерпаемый источник изменчивости микроорганизмов. Именно у микроорганизмов были открыты формы переноса генетического материала. В настоящее время известны три процесса, с помошью которых осуществляется рекомбинация у прокариотов, отличающиеся друг от друга механизмами переноса. Эти процессы - конъюгация, осуществляемая генами плазмид, трансформация- происходящая за счет поглощения свободных участков ДНК и трансдукция - осуществляемая с помощью бактериофагов. Этапы рекомбинации бактерий обеспечиваются соответствующими ферментами: рестриктазами, лигазами и пр.
1. Конъюгация. Под конъюгацией следует понимать перенос генетического материала (хромосомного или плазмидного), осуществляемого путем непосредственного контакта клеток донора и реципиента (лат. conjugatio - соединение).
Далеко не все плазмиды бактерий являются конъюгативными, т.е. имеющими совокупность генов, называемых tra- опероном. Имеются 12 и более генов tra, встроенных в один оперон. Некоторые из них кодируют образование половых пилей. Пили донора представляют собой длинные (до 20 мкм) трубчатые структуры.
Для воспроизведения процесса конъюгации необходим контакт донорской клетки с клеткой-реципиентом. Распознавание донором реципиентной клетки (еще не содержащей фактора переноса) осуществляется за счет донорских пилей, распознающих рецепторы на поверхности клетки реципиента.
У бактерий-доноров перенос плазмиды начинается с выпячивания половых пилей. Их конец касается рецептора стенки клетки- реципиента. Клетка-реципиент прикрепляется к клетке донора, содержащего плазмиду. Для этого, клетка реципиент должна втягивать пили донора внутрь, в результате чего обе клетки соединяются в месте контакта белков клеточных стенок. У дефектных мутантов, неспособных к конъюгации, отсутствует один из главных белков наружной мембраны и изменен липополисахарид, что указывает на их роль в процессе спаривания клеток.
Как только образовались специфические пары клеток донора и реципиента, плазмида донора претерпевает особый тип генетических преобразований, называемых репликацией путем переноса. Например, у F+ плазмиды (англ. fertility-плодовитость) в месте интеграции одна из нитей ДНК разрезается и ее 5΄- конец через донорский мостик протягивается внутрь клетки-реципиента. Одновременно с переносом одной из нитей ДНК у донора и у клетки- реципиента начинают синтезироваться комплементарные нити. В конце репликации нити ДНК, под действием ферментов лигаз, принимают форму кольца. Ни цитоплазма, ни другие элементы клетки-донора реципиенту не переносятся. Процесс репликация продолжается около 2 ч, после чего клетки расходятся, имея свой плазмидный материал. Бывшая клетка-реципиент становится, в нашем примере - F+ клеткой, т.е. которая содержит F плазмиду. Под действием tra-генов на наружной мембране бактерии, содержащей плазмиду, синтезируются определенные белки, которые предотвращают проникновение в нее родственной плазмиды.
Перенос материала хромосом. Клетки, которые содержат F плазмиду, именуются F+ клетками, а клетки, утратившие F+ плазмиду, именуются F- клетками.
Интегрирование F плазмиды с хромосомой клетки проходит с помощью кроссинговера в каждом поколении с частотой 1 на 105 клеток. Кроссинговер - взаимный обмен генами между парными (гомологичными) хромосомами, определяющий образование комбинаций новых генов - их рекомбинации. Клетки, в которых происходит интегрирование, называют Hfr (High-fregy-oncy recombination - высокая частота рекомбинации). Хромосома и плазмида могут нести комплементарные последовательности, эндонуклеаза распознает и расщепляет плазмидную и хромосомную цепи ДНК. Затем они рекомбинируют с образованием большой кольцевой молекулы ДНК. Имеется более 8-10 предпочтительных сайтов (участков) для интеграции генов (объединение частей в одно целое). Процесс интеграции обратим. Каждая популяция F+ клеток содержит несколько Hfr клеток, а каждая популяция Hfr - несколько клеток F+. Плазмида, интегрирующая с хромосомой бактериальной клетки, называется эписомой
Когда суспензия Hfr клеток смешивается с избытком клеток F-, происходит соединение каждой Hfr клетки с F - клеткой и начинается репликация. Перенос нитей ДНК происходит с постоянной скоростью в каждой образовавшейся паре, примерно, 5х104 пар оснований в мин при 37о С. Шансы на перенос снижаются экспоненциально в зависимости от удаления генетического материала от точки переноса.
2. Трансдукция (лат. transductio - перенос, перемещаю). Это перенос генетического материала из клетки-донора в клетку-реципиент с помощью бактериофага. Явление открыто американскими генетиками Ледерберг Д. и Циндер Н. (1952). Фрагменты хромосомы донора переносятся микроорганизму-реципиенту умеренными фагами, обитаюшими в донорской клетке. Трансдукцию наблюдают у многих прокариотических клеток. Процесс трансдукции имеет несколько форм.
1. Генерализованная (общая) трансдукция. Фаги, претерпевшие генерализованную трансдукцию, имеют участки ДНК-хозяина. Вначале головки фагов группируются вокруг определенных сегментов ДНК-хозяина. Включение участка ДНК-хозяина в хромосому фага необходимо для сборки фаговых частиц. Образовавшийся фаг содержит в собственной хромосоме участки ДНК клетки-хозяина и может участвовать в генерализованной трансдукции в клетки-реципиенты любой частицы собственной хромосомы, включая участок ДНК бывшей хозяйской клетки.
2. Рестриктированная (специфическая) трансдукция. Это явление протекает при репликации профага в лизогенной бактерии. Фаговая и бактериальная хромосомы имеют специфические сайтысвязывания. Происходит рекомбинация между двумя сайтами. Для процесса интеграции необходимы определенные гены фага: мутанты фага по этому гену неспособны к лизогении. Упакованная в дочерних клетках ДНК фага, содержит небольшие порции генома хозяина. При этом клетка-реципиент получает определенную часть генома фага и фрагмент хромосомы клетки бывшего хозяина.
3. Трансдукция высокой частоты. Это трансдукция рестриктированной части генома фага содержащей сегмент ДНК-хозяина. Введение такого генома фага в клетку-реципиента, приводит к интегрированию всей новой структуры ДНК фага в хромосому бактерии. Если в реципиентных клетках был нормальный профаг, то образуется лизат, из которого половина частиц фага будет способна к трансдукции. Это высокочастотная трансдукция.
4. Абортивная трансдукция. При генерализованной трансдукции может возникнуть ситуация, при которой экзогенота донора будет неспособной к интегрированию с геномом клетки реципиента, в результате чего экзогенота будет персистировать в клетке без процесса репликации. Экзогенота - это фрагменты хромосомы донора, которые по каким то причинам не могут реплицироваться с хромосомой реципиента и распологаются в клетке в виде отдельной структуры. При делении клетки-реципиента, содержащей экзогеноту, только одна из дочерних особей получит свободную экзогеноту. Результат такого переноса будет заключаться в том, что только одна клетка будет продуцировать фермент за счет функционирования экзогеноты, а другая дочерняя клетка этого фермента иметь не будет, ввиду отсутствия у нее экзогеноты. При дальнейшем делении дочерней клетки, экзогенота будет попадать только в одну из клеток.
3. Трансформация (лат. transformatio - превращение, перестройка). Это поглощение микробом-реципиентом свободной растворенной ДНК, вышедшей из клетки, называемой донором. Явление открыто Ф. Гриффитс (1928). В некоторых бактериальных клетках идет процесс спонтанного освобождения участков хромосомы. При определенных условиях, эти участки донорской хромосомы могут трансформироваться. Это происходит в естественных условиях. У некоторых видов бактерий трансформирующиеся клетки с ДНК высокой молекулярной массы, способны поглощать свободные участки хромосом от любых микробов, хотя генетические рекомбинации образуют близкородственные организмы. Трансформация среди микроорганизмов протекает за счет свободных участков хромосомы, освобождающихся от клеток и попадающих в межклеточную среду при лизисе или активном выделении участков ДНК живыми донорами. Свободные участки ДНК от таких бактерий могут быть как плазмидного, так хромосомного происхождения. Способность бактерий поглощать частицы ДНК называется компетенция, т.к. процесс осуществляется за счет определенных сайтов хромосом реципиента, поглощающих гомологичные участки ДНК. Состояние компетентности появляется у бактерий на стадии деления. Только часть популяции обладает этим свойством в данный период времени. Она зависит от специальных белков, имеющих сродство к участкам ДНК. Двухцепочечные участки свободных ДНК поглощаются быстрее, чем одноцепочечные.
Первая стадия трансформации - это процесс адсорбции двухцепочечной ДНК донора на поверхностных рецепторах бактерии-реципиента. Последовательности ДНК по 8-12 пар оснований распознаются рецепторами клеточной стенки реципиента. Далее выделяют этап ферментативного расщепления связавшегося участка ДНК. Двунитевые участки этих ДНК расщепляются с помощью оболочечных эндонуклеаз. Начинается процесс с внедрения этого генетического материала в клетку-реципиент и в это время фермент разрывает двунитевую ДНК. Окончательному проникновению образовавшихся фрагментов полипептидной цепи, предшествует переваривание ферментами одной из нитей ДНК. Одна непереваренная цепь интегрируется в хромосому клетки реципиента. Рекомбинантная хромосома реципиента состоит из собственного двунитевого генофора, в которой сайт (короткий участок цепи) одной из цепей замещен новой цепочкой ДНК донора.
Трансформация может быть индуцированной, т.е. полученной искусственно. Для этого используют определенные химические вещества, которые способствуют экстракции ДНК из клетки, но при этом требуется защитить ее от действия ферментов - ДНКаз.