Спектрофотометрия.

Для получения температурно-пертурбационных дифференциальных спектров (ТПДС) раствор белка одинаковой концентрации заливается в кварцевые кюветы, которые располагаются в термостатированных ячейках спектрофотометра. При создании разности температур между кюветами регистрируется характерный температурно-пертурбационный дифференциальный спектр, который состоитиз вкладов поглощения триптофановых, тирозиновых и фенилаланиновых остатков, доступных растворителю и изменяющих спектры поглощения в результате изменения струк­туры растворителя под влиянием температуры.

Каждый из хромофоров имеет свой характерный ТПДС. На рис.3б представлен ТПДС триптофана, возникающий в резуль­тате разности температур между кюветами, DT=10°. Дифферен­циальный спектр по форме близок к первой производной от спектра поглощения триптофана (см. рис.3а).

Рис. 2. Блок-схема спектрофотометра.

1— источник света; 2 — линза; 3 — монохроматор; 4 — полупрозрачное зеркало; 5 — отражающие зеркала; 6 —кювета с раствором; 7 —кювета сравнения с растворителем; 8 — призма; 9 — ФЭУ; 10 — усилитель; 11 — самописец.

Для ТПДС триптофана характерно наличие ряда узких максимумов: поло­жительные 293 и 285 нм и отрицательные 289, 278 и 270 нм. Ана­логичным путем получены маркерные ТПДС тирозина и фенилаланина. В ТПДС тирозина – положительные максимумы 287 и 279 нм и отрицательные 282.5, 275 и 267 им. В ТПДС фенилаланина наблюдается ряд узких положительных максимумов – 268.8, 265.5. 259.5, 253 и 247 нм.

Паспортной характеристикой хромофора является температур­ный инкремент экстинкции c_l:

, (5)

где DD_l – дифференциальная оптическая плотность; D_max – оптичес­кая плотность хромофора в максимуме спектра поглощения; DT – разность температур. Для триптофана c₂₉₃=2.12×10^-3 град^-1; для тирозина c₂₈₇= 2.12×lO^-3 град^-1; для фенилаланина c₂₆₅= 3,09×10^-3 град^-1.

Рис.3. Температурно-пертурбационные дифференциальные спектры (ТПДС):

а – химотрипсиногена А в 0.05М фосфатном буфере, рН = 6,8; б – сывороточного альбумина быка в 0,25M KCI. рН = 6,75; 1 – ТПДС изучаемых белков, 2 –ТПДС водных растворов N – Ас – Туr – Oet и N – Ас – Тrр – NH, взятых в молярном соотношении, соответствующих содержанию тирозина и триптофана в исследуемых белках (а – 4:8; б – 18:2); D₂₈₀=1,0; градиент температуры в кюветах 15°.

Доля температурно-пертурбируемых хромофоров белка а опре­деляется как отношение температурного инкремента экстинкции белка c^s к температурному инкременту экстинкции хромо­фора c^м:

, (6)

ТПДС разных белков значительно отличаются между собой; в то же время обычные спектры поглощения для разных белков мало различаются. На рис. 3 представлены ТПДС химотрипсиногена А и сывороточного альбумина быка.

2.4. Сольвентно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия.

При добавлении в раствор белка пертурбантов (метанола, d = 0,28 нм; этиленгликоля, d = 0,44нм; глице­рина, d=0,52нм; глюкозы, d=0,72 нм; сахарозы, d = 0,94 нм, где d – эффективный размер пертурбаната) происходит небольшое смещение спектра поглощения. Если кювету сравнения заполнить раствором белка, а измеряемую кювету — раствором белка и пертурбантом, то на спектрофотометре регистрируется сольвентно-пертурбационный дифференциальный спектр (СПДС). Компенсация по­глощения пертурбанта производится использованием двух тандемных кювет. Использование 20% растворов пертурбантов не изменяет конформациюбелковых молекул.