Динамика белковой структуры.

МАКРОМОЛЕКУЛ

СПЕКТРАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССДЕДОВАНИЯ

 

Наиболее прямым мето­дом, позволяющим изучать пространственное строение белковых молекул, является рентгеноструктурный анализ. На основании данных рентгеноструктурного анализа белковая молекула пред­ставлялась статической системой, в которой неполярные аминокис­лотные остатки образуют жесткое гидрофобное ядро, приближа­ющееся по свойствам больше к твердому телу, чем к жидкости. Благодаря такой жесткости трудно ожидать заметных изменений конформаций при взаимодействии ферментов с субстратами.

Применение спектральных методов (ИК-спектроскопии, ЯМР, флуоресцентного анализа) для изучения белковых молекул заставило критически оценить результаты рентгеноструктурного анализа. Анализ данных водород-дейтериевого обмена в пептидных группах н динамического тушения флуоресценции триптофанилов внутрен­них областей интактных белков свидетельствует о несостоятельно­сти статической концепции белковой структуры и позволяет сфор­мулировать представление о динамических свойствах белков. Наблюдаемая внутримолекулярная подвижность, спонтанные флук­туации структуры белков обусловлены различного рода движени­ями атомов или групп атомов вблизи положения равновесия.

Для белков с известной пространственной структурой Ф. Ри­чардс с помощью специальных расчетов нашел локальные плот­ности и сопоставил их с распределением полярных и гидрофобных аминокислотных остатков по внутреннему объему белков. Оказа­лось, что внутри белка плотность значительно изменяется: есть области высокой плотности (r= 1,4•103 кг•м-3), которым отве­чают высоко упорядоченные участки с a-спиралями и b-структурами, и области с низкой плотностью (r=0,5•103 кг•м-3), куда, как правило, попадают гидрофобные аминокислотные остатки. На основании этих данных сделано заключение о неправомочности понятия гидрофобного ядра для глобулярных белков. По-види­мому, правильнее говорить о гидрофобных кластерах, где преиму­щественно локализованы гидрофобные аминокислотные остатки. Участки с малой локальной плотностью (гидрофобные кластеры) могут служить мягкой жидкоподобной прослойкой для относи­тельного смещения плотных упорядоченных структурных доменов. Для разных белков внутренний интерьер значительно варьирует и может иметь подвижную или более жесткую структуру.

Все внутримолекулярные движения в белках можно разбить на два типа: быстрые спонтанные флуктуации, происходящие за время меньше 10-7 с, и медленные движения за время больше 10-7 с.

Быстрая подвижность (t < 10-7 с) имеет локальный характер внутри макромолекул. Для таких движений характерна зависи­мость t от размера атомных групп, что свидетельствует о наличии диффузионных процессов. Время ориентационной подвижности групп t обратно пропорционально коэффициенту вращательной диффузии Q. С увеличением размера группы t растет пропорци­онально кубу радиуса группы. Большинство быстрых движений проявляется на поверхности белковой молекулы; частично они вовлекают релаксацию связанной воды.

Для примера приведем времена релаксации некоторых атомных групп. Вращательная релаксация свободных молекул воды имеет t»10-11 – 10-12 с; релаксация связанной воды — 10-8 – 10-9 с; вращательная релаксация боковых групп аминокислот — 10-9 – 10-10 с; равновесные конформационные перестройки на уровне со­седних аминокислотных остатков происходят в мили- и микросекундном интервале.

Медленные движения (t > 10-7 с) требуют более масштабных изменений структуры и связаны с перемещением полипептидных цепей или доменов белковых молекул. Например, время жизни фермент-субстратных комплексов занимает интервал от 10-2 до 10-4 с.

Какова физическая природа флуктуации белковых молекул? В настоящее время обсуждаются различные модели динамической структуры белков. Не вызывает сомнений, что атомы в молекуле белка находятся в постоянном движении, и поэтому картина, наблюдаемая при рентгеноструктурном анализе, соответствует не­которой усредненной структуре. Тепловой энергии достаточно, чтобы обеспечить вращательные движения, которые обусловливают атомные флуктуации в молекуле белка. Наиболее быстрые локаль­ные перемещения за 10-13 с связаны с вращением боковых групп вокруг одинарных связей в полипептидной цепи. Эти вращения (на угол от 20° до 60°) практически несогласованны и стерически огра­ничены соседними группами. Такие локальные перемещения бо­ковых групп напоминают броуновское движение в жидкости.

На протяжении более длительного времени (10-12 – 10-11 с) локальные хаотические движения сменяются скоординированны­ми перемещениями атомных групп. Величина таких движений может давать существенный вклад в суммарные амплитуды флук­туации атомов в молекуле белка, вызывая деформацию структуры белка как целого. Значительные смещения в плотно упакованной структуре белка возможны только в том случае, когда происходит кооперативное смещение соседних атомов. Наибольшие смещения (до 0,2 нм) атомных групп наблюдаются на поверхности белковой глобулы.

Динамическая модель позволяет понять роль небольших флук­туации в функции ферментов. Быстрые конформационные измене­ния необходимы в фермент-субстратных комплексах для простран­ственной подгонки функциональных групп в активном центре. На примере алкогольдегидрогеназы печени показано, что крупно­масштабным конформационным перестройкам, изменяющим функ­цию фермента, предшествуют высокочастотные мелкие флуктуации структуры. Алкогольдегидрогеназа состоит из четырех структур­ных доменов, между которыми расположен активный центр фер­мента. Доступность субстрата к активному центру регулируется вращением доменов вокруг шарнирного соединения.

С помощью рентгеноструктурного анализа было установлено, что алкогольдегидрогеназа может пребывать в двух конформациях: открытой, с большим зазором между доменами, и закрытой. После завершения химической реакции фермент принимает открытую конформацию и освобождается от продуктов реакции. Спонтанный переход между этими конформациями происходит за более дли­тельное время (10-9 с), чем время локальных флуктуации (10-12 с). Нужно допустить, что осуществление такого относительно мед­ленного крупномасштабного перемещения доменов в ферменте возможно только тогда, когда в результате небольших, достаточно быстрых локальных флуктуации происходит снижение к минимуму энергетического барьера вращения доменов.

Спектральные методы (дифференциальная спектрофотометр, флуоресцентная спектроскопия, ЯМР) являются конформационно-чувствительными и используются для изучения динамики и конформационных перестроек белков.