Рекомбинантная ДНК и рестриктазы

ВМЕШАТЕЛbСТВО В СТРОЕНИЕ ДНК: ВОЗВРАЩЕНИЕ ЭПИМЕТЕЯ?

В древнегреческих мифах говорилось о титанах — расе гигантов, рожденных богами прежде расы людей. Титану Эпиметею боги поручили создать животных и растения, распределив между ними разнообразные свойства. Но Эпиметеи (его имя переводится как «думающий после») взялся за дело слишком поспешно и исчерпал весь запас свойств, прежде чем дошел до людей. Поэтому он попросил своего брата Прометея похитить у богов огонь и подарить его людям. Этот поступок навлек гнев Зевса, пославшего Эпиметею прекрасную жену Пандору, которая должна была доставить ему немало страданий. Пандора открыла запретный ящик (также посланный на землю Зевсом), в котором хранились все бедствия и несчастья мира. Сегодня многие уверены в том, что генетики подобно современным Эпиметеям бездумно вмешиваются в тайны природы и могут нечаянно выпустить разнообразные бедствия из научного ящика Пандоры. Эти страхи еще более усилились, после того как генетики научились изменять строение ДНК. Теперь они стали подобны богам, получив возможность создавать организмы, которые никогда не существовали и не могли бы существовать без этой новой технологии.

Мы уже говорили, как, начиная с ранних эпох скотоводства и земледелия люди пытались выращивать новые сорта растений и разводить новые породы животных. Законы Менделя в XX веке помогли людям улучшить традиционные способы селекции, но все изменения до сих пор происходили только внутри отдельных видов. С появлением генных технологий в одном организме можно объединить признаки сразу нескольких других организмов, подобно тому как в древнегреческой мифологии созданное богами огнедышащее чудовище Химера изображалось с телом льва, головой козла и хвостом змеи. В данной главе мы поговорим именно об этом виде вмешательства в ДНК. Затрагиваемые при этом этические и социальные вопросы обсуждаются в следующей главе.

К 1972 году Анни Чанг, Поль Берг и Сеймур Коэн установили, что при помощи рестрикционных ферментов, рестриктаз, можно порезать две любые молекулы ДНК и сделать из них одну реком-бинантную ДНК. Именно это открытие легло в основу новой технологии, революционным образом преобразившей современную генетику и молекулярную биологию. Метод основан на стремлении комплементарных одинарных цепей нуклеиновых кислот соединиться между собой. Так, в растворе нуклеиновых кислот цепь с последовательностью GCTAT соединится с цепью CGATA. Особое внимание следует уделить тому, как рестриктазы режут ДНК. Вспомним, что большинство рестриктаз разрезают симметричные палиндромные фрагменты и часто оставляют короткие одинарные комплементарные концы цепей длиной в два—четыре основания. Например, фермент Sail режет ДНК следующим образом:

Все молекулы ДНК, порезанные этой рестрикта-зой, будут иметь одинарные фрагменты с одинаковой последовательностью. Эти концы могут соединяться посредством водородной связи, даже если они очень короткие. Поэтому если порезать две ДНК разных организмов одним ферментом и затем перемешать их, то можно получить много рекомбинантных молекул, составленных из ДНК обоих видов.

На практике эксперимент, как правило, сосредоточен на ДНК отдельного организма-донора, например мыши или человека. Эту ДНК изолируют и проводят над ней различные операции. Выделить ДНК из организма донора просто: достаточно разрушить клетки и при помощи этанола выделить осадок ДНК. Затем донорскую ДНК обрабатывают рестриктазой, чтобы она поделилась на мелкие фрагменты и эти мелкие фрагменты вставляют в маленькие реплицирующие молекулы ДНК, служащие вектором (лат. vector — несущий); векторные молекулы переносят интересующую ученых ДНК, с которой можно экспериментировать. Векторы могут реплицироваться, то есть увеличивать количество донорских фрагментов и предоставлять много копий для анализа. Наиболее часто использующиеся векторы — плазмиды, с которыми мы познакомились в гл. 10, то есть маленькие кольцевые ДНК, встречающиеся в бактериях и часто переносящие гены устойчивости к антибиотикам. Плазмиды не являются частью основного генома бактерий, поскольку встречаются штаммы, как с плазмидами, так и без них. Благодаря малому размеру и кольцевой структуре плаз-мидных ДНК их легко отделить от геномной ДНК бактерий. В качестве векторов также часто используют маленькие вирусные ДНК.

Порезав донорскую ДНК на фрагменты при помощи рестриктазы, той же рестриктазой режут векторную молекулу, имеющую один участок, соответствующий рестриктазе. Затем раствор двух ДНК смешивают и получают некоторое количество рекомбинантных молекул ДНК — это и есть векторы со встроенным донорским фрагментом:

Такие вставки нестабильны, но если добавить фермент ДНК-лигазу, то он соединит каркас молекул ДНК и сделает связь прочной. В полученном растворе имеется большое количество векторных молекул с различными донорскими вставками. Следующим шагом необходимо внедрить эти рекомбинантные молекулы в живые клетки, где они могли бы реплицироваться. Если в качестве векторов используют плазмиды, то раствор рекомбинантной ДНК просто добавляют в культуру бактерий без плазмид, обычно Е. coli. При надлежащей обработке клетки впитывают рекомбинантные векторы через стенки и мембраны. Обычно в одну клетку проникает только одна молекула. После посева в чашки клетки растут и делятся, увеличивая количество плазмид и вставок в них. Каждая из получившихся колоний бактерий является клоном ДНК, то есть популяцией идентичных бактериальных клеток, в которой размножается фрагмент донорской ДНК.

Ученые ведут учет этим колониям и сохраняют их. Вместе они образуют геномную библиотеку (банк). Если выведено и собрано достаточное количество колоний, то существует вероятность, что каждая отдельная часть донорского генома представлена в библиотеке хотя бы один раз. Так можно составить библиотеку геномной ДНК мыши, фрагменты которой представлены в виде вставок в плазмидные векторы внутри клеток бактерий.

Следующий шаг во многом зависит от цели эксперимента. С некоторыми возможностями мы познакомимся ниже.