Методы генной инженерии 1 страница

Понятие о генной инженерии. Рекомбинантные ДНК, принципы их конструирования. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in vivo. Определение по нятия вектора в биологии. Векторы: плазмиды, бактериофаги, космиды, искусственные хромосомы. Методы поиска специфических рекомбинантных ДНК. Геномные ДНК-библиотеки, библиотеки кДНК.

Трансгенные организмы. Принцип конструирования трансгенных организмов. Трансгенные бактерии. Главные направления применения в народном хозяйстве и медицине. Рекомбинантные лекарственные препараты. Трансгенные растения. Главные направления использования трансгенных растений. Трансгенные животные как модели заболеваний и биореакторы. Проблемы экологической безопасности.

Генная терапия. Принципы генной терапии. Генотерапия ex vivo и in vivo. Вирусные и невирусные векторы в генотерапии. Перспективы и ограничения генной терапии. Генные вакцины. Генная терапия в онкологии.

Генная инженерия. Технология рекомбинантных ДНК. Генная инженерия возникла в 1972 году, в Станфордском университете, в США. Тогда лаборатория П. Берга получила первую рекомбинатную (гибридную) ДНК или рекДНК. Она соединяла в себе фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса SV40.

В начале 1970-х молекулярные биологи разработали принципиаль­но новые технологии, основанные на открытиях в области биохимии и молекулярной генетики. Это предоставило огромные возможности манипулирования генетическим материалом. Новые подходы и методы получили название «технологии рекомбинантных ДНК», часто называе­мые «генной инженерией». Эти технологии революционизировали био­логию и оказали огромное влияние на медицину. С их помощью можно производить обмен генетической информацией между хромосомами, создавая новые геномы. Например, можно получать трансгенные орга­низмы, бактерии, экспрессирующие гены человека, проводить генную терапию человека и др. Таким образом, генная инженерия — это раздел молекулярной генетики, использующий различные методы манипуля­ций с нуклеиновыми кислотами (технологии рекомбинантных ДНК) для целенаправленного изменения генетических программ и создания новых генотипов. Генная инженерия состоит из следующих основных этапов: а) полу­чение генетического материала, содержащего нужные гены; б) включе­ние этих генов в автономную генетическую систему (вектор), способную к репликации и встраиванию в чужой геном; в) введение этой системы в реципиентную клетку, где новые гены входят в состав ДНК. На ука­занных этапах используется много молекулярно-генетических подходов и методов. Рассмотрим некоторые из них.

Генетический материал можно получать двумя способами: путем химического синтеза и путем ферментативной рестрикции ДНК.

Химический синтез ДНК осуществляется из нуклеотидов в спе­циальных условиях (рис.55 А) на основе полностью расшифрован­ной нуклеотидной

Рис.55. Схемы путей синтеза генетического материала

А - синтез из нуклеотидов; Б - синтез на основе обратной транскрипции мРНК: 1 - получение мРНК из клеток; 2 — обратная транскрипция; 3 — образование двухцепочечной кДНК

последовательности определенного участка ДНК. Искусственный ген аланиновой тРНК был впервые синтезирован Г. Кораной в 1970 г. Этот ген состоял из 77 пар нуклеотидов, но не имел регуляторных отделов и поэтому не функционировал. Спустя не­сколько лет Корана синтезировал ген тирозиновой тРНК, содержащий промотор и терминатор. Этот ген, введенный бактериям, функциони­ровал как натуральный. В настоящее время синтезировано уже много разнообразных генов.

Синтез некоторых генов можно проводить также с помощью мРНК и ферментов обратной транскрипции (рис.55 Б). В определенных условиях на матрице мРНК с помощью специальных ферментов ревертаз синтезируется комплементарная цепь ДНК. Затем на ней как на матрице образуется вторая цепь ДНК. Такая искусственно полученная молекула называется ДНК-копией или кДНК.

Рестрикция ДНК— это процесс «разрезания» молекул ДНК про­кариот и эукариот специальными ферментами, что позволяет получать участки, содержащие определенные гены.

Одним из важнейших инструментов генной инженерии являются эндонуклеазы — ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим по­следовательностям нуклеотидов внутри цепи. Эти ферменты получили название рестриктаз. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках строго определенных последова­тельностей (рис.56). Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических или физических воздействий, приво­дящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются

Рис.56. Схема рестрикции ДНК (А) и образование рекомбинантной (химерной) ДНК (Б): 1. Рестриктазы распознают определенные нуклеотидные последовательности ДНК и «разрезают» ее в местах, обозначенных стрелками. 2. Фрагмент исходной ДНК с «липкими концами», готовыми к комплементарному взаимодействию. 3. Фрагмент «чужой» ДНК, полученный также после рестрикции тем же видом рестриктаз. 4. Рекомбинантная (химерная) ДНК, состоящая из «своих» и «чужих» генов

частью защитной системы бактерий, охраняющих собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной ДНК. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRI свидетельствует о том, что этот фермент из Esherichia coli. ВатН1 — из Bacillus amilolquefacientsi. Каждый фермент узнает определенную 4-7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктаз Hpal), либо «липких», то есть перекрывающихся (например, ВатН1), концов. Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы (рис.56). Любой фрагмент ДНК об­ладает характерным расположением сайтов узнавания различных ре­стриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участ­ки. Такие фрагменты можно разделить и идентифицировать методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Биологические векторы: (плазмиды, бактериофаги, космиды, искусственные хромосомы).

Вектор — это нечто вроде молекулярного «такси», способного пере­носить чужую ДНК внутрь клетки-хозяина таким образом, чтобы она там могла реплицироваться.

Вектор, включающий в себя фрагменты чужеродной ДНК, должен проникать в реципиентные клетки, выбранные для клонирования гена. Эти клетки могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их легко получать в большом количестве. Встроенные в плазмиды чужие гены переда­ются в клетку хозяина путем трансдукции и встраиваются в их геном, где способны к быстрой репликации с помощью ферментов клетки-хозяина. Процесс быстрого получения большого количества оди­наковых копий молекул называется клонированием. Клон — это большая популяция идентичных молекул, клеток, организмов, полученных от одного предка. Путем клонирования вектора в реципиентных клетках можно обеспечить получение большого количества нужного гена в высокоочищенном виде или большого количества белка, кодируемого данным геном. В геном животных фрагменты чужой ДНК вводят путем микроинъекции непосредственно в ядро клетки.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Бактериальные плазмиды — это небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, в функции которых входит, например, обеспече­ние устойчивости к антибиотикам. Плазмиды обладают несколькими свойствами, которые делают их чрезвычайно удобными для использова­ния в качестве векторов. В частности в бактериальной клетке они могут существовать во множестве копий, могут реплицироваться независимо от хозяйской ДНК. Для многих плазмид известна полная нуклеотидная последовательность. Это делает возможным точную локализацию сайтов рестрикции для клонирования фрагментов ДНК. Плазмиды значительно меньше хозяйской хромосомной ДНК и поэтому могут быть легко отделены от нее. Клонированный фрагмент легко выделяется из рекомбинантной плазмиды посредством ее расщепления той же рестриктазой.

Бактериофаги обычно содержат линейную ДНК, в которую могут быть встроены фрагменты чужеродной ДНК по какому-либо из доступных сайтов рестрикции. Основным преимуществом фаговых векторов перед плазмидными является то, что в них удается встраивать в 2-3 раза более крупные фрагменты «чужой» ДНК.

Рис.57. Схема основных этапов и методов генной инженерии:

1 — получение ДНК из ядер; 2 — рестрикция ДНК на фрагменты (фрагмент 6 содержит интересующий нас ген); 3 — разделение фрагментов с помощью электрофореза; 4 — идентификация интересую­щего нас фрагмента методом гибридизации со специальным ДНК-зондом; 5 — выделение нужного фрагмента; 6 — синтез нужного фрагмента; 7 — клонирование фрагментов мето­дом ПЦР; 8 — включение фрагмента ДНК в плазмиду (вектор); 9 — введение плазмиды в бактерию; 10 — введение фрагмента ДНК непосредственно в ядро клетки реципиента; 11 — рестрикция плазмиды; 12 — включение в плазмиду фрагмента ДНК

Необходимые гены вырезаются из хромосом животных, инкуби­руются с плазмидами или фагами, которые также разрезаны специ­альными рестриктазами (рис.56 и 57). Через некоторое время фрагменты разных ДНК соединяются в соответствии с принципом комплементарности и ДНК плазмиды восстанавливает исходную кольцевую форму. Так можно соединять отрезки ДНК, полученные из разных клеток и создавать комбинации разнообразных генов в одной молекуле. Для соединения участков ДНК применяют лигазу — один из ферментов репарации. Процесс ковалентного соединения «липких» концов фрагментов ДНК называют «лигированием». Используя раз­личные рестриктазы и лигазы, можно разрезать и сшивать нить ДНК в разных местах и получать разнообразные рекомбинантные (химер­ные) молекулы.

Космиды. Векторы, называемые космидами, могут включать до 40 тысяч пар нуклеотидов чужеродной ДНК и при этом активно амплифицироваться в Е. coli как плазмиды. Космиды обьединяют в себе свойства плазмидных векторов и векторов на основе фага λ. Например, широко применяемая космида pLFR-5 (приблизительно 6 тысяч пар нуклеотидов) имеет два cos-сайта фага λ, точку начала репликации ДНК и ген устойчивости к тетрациклину. Эта космида может интегрировать чужеродную ДНК, длина которой до 40 тысяч пар нуклеотидов.

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию cos-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироватся как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком; трансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага λ.

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами: в них можно встраивать более длинные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг.

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 тысяч пар нуклеотидов) имеют большую ценность

при анализе сложных эукариотических генов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека. В отличие от библиотек с небольшими вставками чаще всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которое нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в «своем» клоне.

Искусственные хромосомы. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 3000 тысяч пар нуклеотидов был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1. Это химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 тысяч пар нуклеотидов, на основе F- плазмиды E.coli, которая представлена в клетке одной или двумя копиями с селекционной системой lac Z - эта конструкция называется бактериальной искусственной хромосомой.

Искусственные хромосомы содержат три основных элемента: концевые участки (теломеры), центромеру и точки инициации репликации. Свойства теломерных областей хромосом человека хорошо изучены, чего нельзя сказать о центромерах и точках инициации репликации. Существовали опасения, что искусственные хромосомы не удастся сконструировать, пока не будут досконально изучены все ее элементы. Однако уже получены и поддерживаются в трансфицированой культуре клеток стабильные, линейные, искусственные хромосомы человека (микрохромосомы), состоящие из множества ДНК повторов (длиной около 1 миллиона пар нуклеотидов), центромерной области, высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК и теломерных участков. В их центромерную область был встроен ген устойчивости к неомицину, что позволило использовать среду С 418 в качестве селективной.

Две из трех микрохромосом были получены «усечением» существующей хромосомы. В одном случае исходная центромера была сохранена, а в другом заменена трансфицированой центромерной областью. Третью, полностью искусственную микрохромосому получили лигированием in vitro трех трансфицированных ДНК-элементов. Ясно, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей «терапевтические» гены, вполне реально. Основной проблемой станет доставка этой огромной молекулы ДНК в ядро клетки-мишени. Кроме, того, экспрессия генов, входящих в состав ДНК-блоков, из которых построена искусственная хромосома, может оказывать вредное воздействие на клетки-мишени. Для начала в ткани пациента можно попытаться имплантировать инкапсулированные клетки с искусственными хромосомами. Совсем недавно учеными были созданы лентивирусные векторы. Они широко используются при генетических заболеваниях, так как их структура допускает перенос больших генов, например генов гемоглобинов, факторов свертывания VIII, IX и других. Главное преимущество лентивирусных векторов перед другими ретровирусами - в возможности интеграции в геном всех клеток. Это особенно важно для переноса генов в примитивные стволовые кроветворные клетки, так как основная масса последних находится вне клеточного цикла, а мобилизация в цикл существенно сказывается на пролиферативном потенциале и судьбе стволовых кроветворных клеток при трансплантации.

Геномные библиотеки и кДНК библиотеки. Подобрав соответ­ствующие условия рестрикции и клонирования можно добиться того, что в наборе клонированных фрагментов будут содержаться практиче­ски все гены данного генома. Такие коллекции клонов, полученные от конкретного генома, называют геномными «библиотеками». Геномная библиотека готовится из тотальной ДНК клеточной линии или ткани.

В отличие от геномной библиотеки, библиотека кДНК готовится из мРНК ткани. Библиотека кДНК также состоящая из всех генов данного генома готовится в несколько этапов. Сначала выделяют тотальную мРНК ткани. Затем с помощью обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы проводят обратную транскрипцию мРНК в двухцепочечную ДНК (кДНК). Указанные «библиотеки» используются для изучения нуклеотидной последовательности, локализации генов, их структуры и патологии.

Трансгенные организмы. Принцип конструирования. Трансгенез - искусственный перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспресии (т.е. выражения: транскрипции, трансляции, приводящих к появлению в клетках организма-реципиента
биологически активного генного продукта). Основой для развития исследовательских работ по межвидовому транспорту генов послужили серьезные достижения последних десяти лет в области генной инженерии - т. е. технологии манипулирования с рекомбинантной ДНК.

Его цель — получение организмов с новыми признаками, изменение наследственности сложных много­клеточных организмов. Такие организмы называют трансгенными. Для трансгенеза используют несколько методических приемов — ин­тродукция генов в изолированные клетки реципиента с последующей ретрансплантацией этих клеток, инъекция гена непосредственно в орга­низм реципиента, интродукция клонированных генов в геном эмбриона на ранних стадиях развития. Чаще всего используют последний метод. При этом из материнского организма (например, мыши) берут только что оплодотворенную яйцеклетку. В зону мужского пронуклеуса путем инъекции вводят клонированные гены, потом самкам пересаживают эмбрионы, которые развивались в культуральных средах. При этом до­стигается довольно высокий уровень имплантации и рождение полно­ценных мышей. В процессе трансгенеза происходит встраивание нового гена в геном зародыша. Вследствие этого получают животных с новым геном и они обеспечивают передачу его следующему поколению пу­тем полового размножения. Следует также учитывать, что введенный ген обычно встраивается в одну из гомологичных хромосом, поэтому трансгенными будут не все потомки. Осуществлено успешное перене­сение в геном мыши гена гормона роста человека. Масса трансгенных мышей и их потомков была в 1,5-2 раза больше. Ныне широко ведутся исследования по получению трансгенных кроликов, овец, птицы, свиней. Быстрыми темпами разрабатываются методы создания трансгенных жи­вотных, которые могут синтезировать некоторые препараты (инсулин, интерферон, факторы свертываемости крови, гормоны, незаменимые аминокислоты).

В перспективе есть возможность получать так называемых транс­генных животных, в зиготу которых будет внесено несколько генов (политрансгенные животные). Но при этом возникает опасность раз­рушения эволюционно сбалансированного генома животных.

Введение генов в клетки и их экспрессия. После растворения за­щитной оболочки протеолитическими ферментами с яйцеклеткой мож­но проводить разные манипуляции и вводить в нее микроколичества нуклеиновой кислоты. Яйцеклетку диаметром около 0,1 мм помещают на конец микропипетки, и экспериментатор с помощью микроскопа и стеклянного капилляра с внешним диаметром не более нескольких десятков микрон вводит в яйцо несколько пиколитров (10-12 пл.) чужих фрагментов ДНК. Инъекция — наиболее ответственный этап эксперимента, поскольку в этот момент можно нанести значительные повреждения яйцу или эмбриону. Наилучшая интеграция и экспрессия генов достигается при инъекции в мужской пронуклеус, что разрешает свести к минимуму повреждения ооцита, поскольку пронуклеус рас­полагается близ его мембраны. Таким образом, удается добиться вклю­чения одного или нескольких генов в геном эмбрионов млекопитающих. Эти гены могут экспрессироваться и передаваться потомкам. Следует подчеркнуть некоторые сложности и неясности, с которыми связана эта процедура. Процесс интеграции генов в геном клеток млекопитающих является малоизученным. Как показали исследования, эта интеграция происходит случайным образом и не связана с конкретным участком хромосомы. Другая сложность обусловлена нестабильностью клеток, в которые вводится ген (или гены), где он может быть утерянным, видоизмененным или неактивным. Активность генов определяется не только последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают транскрипцию генов с образованием мРНК, но также другими после­довательностями нуклеотидов, которые стоят отдаленно от собственно гена. Для достижения полной экспрессии гена эти последовательности необходимо вводить вместе с ним.

Трансгенные бактерии.В разных сферах хозяйственной деятельности человека используются трансгенные бактерии. Кроме того, что бактерии используются для клонирования генов и производства белка, они реконструируются и для других целей.

Так, биоинженерные бактерии используются для оздоровления растений. Бактерии, что живут в растениях и стимулируют образования кусочков льда, были изменены с холод-плюс на холод-минус растения. Такие бактерии начали защищать вегетативные части растений от мороза. У бактерий, что образуют симбиоз с корнями кукурузы, были введены гены (от других бактерий), что кодируют токсин для вредных насекомых.

В природе существуют бактерии, что могут расщеплять любое органическое вещество. Бактерии отбираются за способностью расщеплять определенное вещество, а затем эта способность усили­вается во время биотехнологии. Таким путем были образованы бактерии, которые поедают нефть, что разлилась во время техногенных катастроф.

Бактерии используют для бактериального синтеза. Так, были реконструированы бактерии для производства аминокислоты фенилаланина.

Широкое использование рекомбинантных бактерий в сельском хозяйстве, промышленности, защите окружающей среды ограничива­лось тем, что такие бактерии могут заменить природные микроорга­низмы в экосистемах с возникновением неблагоприятных последст­вий. На сегодняшний день разработаны методы определения, измере­ния и даже блокирование деятельности этих клеток в окружающей среде.

Рекомбинантные лекарственные препараты. Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное получение человеческого инсулина в промышленных масштабах. Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года в США, Японии, Великобритании и других странах производят генно-инженерный инсулин. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организма диабетиков животным инсулином.

Более двадцати фирм Японии и несколько американских фирм разрабатывали другой очень важный медицинский препарат- интерферон, который эффективен при различных вирусных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Первым из этих соединений на рынок поступил альфа-интерферон, затем бета-интерферон.

Еще один эффективный противораковый препарат - интерлейкин производится в Японии и США. Интересно отметить, что сегодня американский рынок медицинских препаратов, полученных методами генной инженерии, сравним с такими массовыми лекарствами, как антибиотики.

Трансгенные растения. На начальном этапе развития исследовательских работ по трансгенезу у эукариотических организмов одной из основных проблем являлся поиск и конструирование векторов-носителей для переброски «полезных» генов. Сейчас эта проблема в значительной степени решена, что дало серьезный импульс распространению трансгенных манипуляций с растениями и животными. В отношении растений наиболее используемыми векторами - носителями являются Ti (tumor inducing) и Ri (root-inducing) плазмиды, выделенные из бактерий, способных образовывать с высшими растениями сложные симбиотические ассоциации. Ti плазмиды содержат в составе своей ДНК так называемые Т-участки (от английского transfer - перенос), способные встраиваться в ядерный геном некоторых растений. Встраивание в Т-участок нужного гена превращает Ti-плазмиду в вектор - носитель для трансгенных манипуляций. Необходимо также отметить, что генная инженерия и трансгенез у растений могут затрагивать не только ядерный наследственный материал, но и ДНК хлоропластов и митохондрий. Так, в митохондриях кукурузы были обнаружены плазмиды S-1 и S-2, что открывает определенные возможности для введения туда чужеродных генов.

В результате детального изучения молекулярно-генетических ос­нов опухолевого роста у растений при участии бактерий рода Agrobacterium оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий (Ti - tumor inducing, индуцирующая опухоль), представляющие со­бой мини-кольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии, которая составляет 12-22 тыс. пар основа­ний, пе­реносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, в которую встраивается «нужный» ген. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые исполь­зуются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методология для по­знания фундаментальных основ организации и функционирования раститель­ного генома.

Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. В геном расте­ния могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромо­сому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскриби­руется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транс­крипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует расти­тельные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины -источник азота и углерода.

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по сущест­ву идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений.

Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков.

Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследует­ся как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяю­щая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна:

· содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной
интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток;

· не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт достигается с помощью транспозонного мутагенеза.

В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, ко­торые приводят к опухолеобразованию, что не отражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Тп 5, Тп 7).

Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть пре­дусмотрено наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор (участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, актив­ность которых индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтез запасных бел­ков, например зеина, который обнаружен только в тканях семян злаков. Наибо­лее популярным является промотор гена вируса мозаики цветной капусты 12 (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях.

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB -это гены, выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в ос­новную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популяр­ностью другой репортерный ген - pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria. Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т- ДНК заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Создан даже специальный прибор -«Shotgun», который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя, таким образом, трансформацию растительных клеток.

Рис.58. Генетическая колонизация высшего растения бактерией A. tumefaciens: 1 - A. tumefaciens существует в ризосфере (корневой сфере) растения; 2 - в клетках бактерии наряду с ее хромосомой существует Тi-плазмида; 3 - Ti-плазмида проникает в клетку растения, и часть ее (T-ДНК) встраивается в геном растения; 4 - это приводит к образованию опухоли - корончатого галла и синтезу опинов